从蚊虫匀浆物中分离蚊媒相关病毒

摘要

来源：Huang, D., 等．从野外采集的蚊子中分离蚊媒相关病毒．J. Vis. Exp．(2022)．

本视频演示了逐步操作的完整流程 体外 利用成纤维细胞样哺乳动物细胞从蚊虫匀浆中分离蚊媒相关病毒

方案

1. 病毒分离
   注意： 所有步骤均在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。生物安全实验室所需的安全等级应根据各国和地区法规进行生物安全风险评估后确定。操作过程必须在生物安全柜中进行。
   1. 从24孔板中移除细胞培养基，每孔加入100 µL细胞维持培养基和100 µL蚊子匀浆上清液（P0）。
   2. 将培养板置于28 °C或37 °C孵育60分钟，每15分钟轻轻振荡一次，以防止细胞干燥。
   3. 吸除上清液，然后用 600 µL 细胞培养维持培养基轻轻冲洗每个孔，以彻底去除碎片。
   4. 向每个孔中加入 800 µL 细胞培养维持培养基，并将培养板置于 5% CO₂ 培养箱中₂ 在28 °C或37 °C的加湿培养箱中培养7天。
   5. 每天在显微镜下观察每个孔的细胞状态。
   6. 收集细胞上清液（P1 上清液）于第 7 天^th 天，并将上清液于 -80 °C 保存。
   7. 重复步骤 1.1–1.6 两次，以获得 P2 和 P3 上清液。
      注意： 在步骤1.3中，用600 µL细胞培养维持培养基轻轻冲洗P2和P3的每个孔为可选步骤。
   8. 根据出现细胞病变效应（CPE）的孔，即细胞死亡、核固缩并从表面脱落；与邻近细胞融合形成合胞体；或出现核内或胞浆内包涵体，向每块新的6孔板中含细胞的各孔（细胞融合度为80%–90%）加入该CPE孔的上清液300–400 µL，以大量扩增病毒。
   9. 收集上清液，分装至2 mL螺口储存管中（每管500 µL），于-80 °C保存。
      注意： 经过连续三代的细胞传代后，未引起细胞病变效应（CPE）的样品被弃用。如有必要，可增加细胞连续传代的代数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔板	CORNING	3524	细胞培养容器
带螺帽储存管（2 mL）	biofil	FCT010005
冰箱（-80 °C）	sanyo	MDF-U54V
培养箱（37 °C）	Panasonic	MCO-18AC	细胞培养仪器
杜尔贝科改良必需培养基（DMEM）	Gibco	C11995500BT	用于脊椎动物细胞系的培养基