螺旋体细菌中噬菌体介导的基因递送

来源：Eggers, C. H. 噬菌体介导的莱姆病螺旋体Borrelia burgdorferi的遗传操作。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了利用聚乙二醇沉淀的、携带卡那霉素抗性质粒的非感染性噬菌体，对基因改造的Borrelia螺旋体进行转导的过程。将噬菌体与细菌共孵育后，菌液被涂布于添加抗生素的培养基上。只有成功获得质粒的细胞才能存活并形成菌落。随后挑取这些菌落，并在含抗生素的液体培养基中扩增，以建立稳定携带质粒的细菌种群，用于后续实验应用

1. 噬菌体φBB-1经聚乙二醇（PEG）沉淀后的转导实验

准备 B. burgdorferi 用于转导实验的受体菌培养物。根据所测定的密度，计算获得15 mL浓度为1的受体菌培养物体积 × 107 个螺旋体·mL−1
在 6,000 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 14.5 mL 新鲜 BSK（Barbour-Stoenner-Kelly）培养基中。
加入 ≤500 µL 将PEG沉淀的噬菌体样品加入受体克隆培养物中。充分混匀，并在 33 °C 72–96 小时。
注意： 聚乙二醇沉淀过程中回收的噬菌体量可能因多种因素而有所变化。然而，从15 mL诱导培养物中 B. burgdorferi 菌株 CA-11.2A， 500 µL 通常含有 50–1,000 个有活力的噬菌体28。噬菌体回收体积 ≥500 µL 对……产生不利影响 B. burgdorferi 生长，可能是由于SM（悬浮培养基）与BSK的比值增加所致。
通过与聚乙二醇沉淀的噬菌体混合后，采用固体培养基平板法筛选转导子。

2. 转导子的筛选

注意：对潜在转导子进行固体培养基平板培养时，采用对该方案的单层改良方法。B. burgdorferi菌落在琼脂内部生长，因此在倒平板时必须将样品加入培养基中，以实现通过固体培养基平板筛选转导子。该技术也可能有效用于转导子的筛选，但尚未针对此目的进行尝试。

根据待涂布的转导实验组和对照组样本数量，确定筛选转导子所需的培养皿数量。
注意： 通常每个样本倒两块平板，一块相当于培养物体积的约10%，另一块包含剩余的培养物。此外，还需制备作为阴性对照的倒平板，用于单独检测在筛选过程中使用的噬菌体制备物和/或作为供体与受体的亲本克隆是否能在所用抗生素存在下生长。建议额外准备至少两块平板所需的培养基材料。例如，若待倒平板的样本和对照总数为八块，则应准备足够用于10块平板的培养基混合物。
按照下述方法准备用于涂布的溶液。
注意： 每个平板体积为30 mL，由20 mL用于铺板的1.5x BSK培养基和10 mL 2.1%琼脂糖（2:1比例）组成。最终得到的平板中BSK浓度为1x，琼脂糖浓度为0.7%。例如，制备10个平板时，共需300 mL铺板混合液，包含200 mL 1.5x BSK培养基和100 mL 2.1%琼脂糖。
1. 使用所列的各组分用量配制1 L的1.5倍浓度BSK培养基。储存方法同1倍浓度BSK培养基所述。
2. 在水中配制2.1%琼脂糖溶液，高压灭菌。该琼脂糖溶液可新鲜使用，或于室温保存。若在室温保存，使用前需盖上容器盖子（留缝隙），用微波炉加热至完全熔化后再进行涂布。
3. 根据整个涂布混合物的体积，确定达到适当浓度所需的抗生素体积。
  注意： 如果最终涂布液的总体积为300 mL，则混合200 mL的1.5倍浓度BSK培养基和足量抗生素，以确保整个300 mL溶液达到正确的终末抗生素浓度。若转导实验中的供体和受体分别携带不同的抗生素抗性基因，则涂布混合液中应包含两种抗生素。若来自供体的PEG沉淀噬菌体编码一种抗生素抗性标记而受体无任何抗性基因，则涂布混合液中仅需加入一种抗生素。
根据需要倒制的平板数量，将适量的1.5倍浓度BSK培养基和抗生素转移至一个无菌瓶中，该瓶需足够大以容纳全部倾注混合液。随后在水浴中平衡至 56 °C 至少15分钟
将高压灭菌或微波加热后的熔融琼脂糖在水浴中平衡至适宜温度 56 °C 水浴至少15分钟。
平衡后，将确定量的2.1%琼脂糖加入含有1.5倍BSK（含抗生素）的瓶中，并将铺板溶液重新放入水浴中 42 °C 10-15 分钟
注意： 较高温度可能损伤或杀死螺旋体36。若使用上述同一水浴，需将水浴冷却至42-45 °C 开始计时平衡前。不要让铺板溶液在 42 °C 超过20分钟后，该物质在倒平板时会开始凝固。
在平衡过程中，准备 B. burgdorferi 待涂布样品。将待涂布的量转移至无菌50 mL锥形离心管中
若接种量少于 1.5 mL（<将最终30 mL平板体积的5%转移至新离心管中，并在涂布过程中直接向样品中加入涂布混合液。
1. 对于较大体积，将所需体积的培养物转移至新离心管中，然后在室温下以 6,000 x g 离心 10 分钟。弃去上清液，仅保留 100-500 µL 离心后保留上清液，并用剩余液体完全重悬沉淀物，然后进行涂布。
2. 共培养后，对于对照组平板，向无菌50 mL锥形离心管中加入≥107个供体或受体克隆细胞。若体积超过1.5 mL，需离心并重悬沉淀。若使用聚乙二醇沉淀的噬菌体进行了转导实验，除受体克隆外，还需加入100-250 µL 将噬菌体样品加入无菌的50 mL锥形管中用于涂布。
待涂布溶液在42-45 °C 孵育10-15分钟后，将30 mL涂布液转移至含有相应样品的离心管中；立即把涂布混合液和样品加入已标记的平板中。每个样品使用新的移液器重复操作。
让平板静置凝固 15–20 分钟，然后将其放入 33 °C 添加5% CO₂的培养箱₂倒平板后至少48小时内不得倒置培养皿。
根据受体克隆的背景，检查在选择性平板上经10-21天培养后菌落是否出现在琼脂糖内。使用经灭菌的带棉塞硼硅酸盐玻璃吸管（5.75英寸），挑取至少5-10个在两种抗生素存在下生长的菌落，接种至1.5 mL含适当抗生素的1x BSK培养基中。
培养接种的菌落 33 °C 培养3至5天，或直至在200倍暗视野显微镜下每个视野中约有20至40个螺旋体。
注意： 筛选后，可将螺旋体冷冻，于 −80 °C 通过将等体积的培养物与过滤除菌的60%甘油和40% 1x BSK混合 0.22 µm 过滤器

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 圆锥形离心管（聚丙烯）	USA Scientific	5618-8271
丝裂霉素 C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	注意：潜在致癌物；仅可在化学通风橱中使用
5.75" 马克西吸管（带棉塞、硼硅酸盐玻璃、非无菌）	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	使用前需高压灭菌
50 mL 圆锥形离心管（聚丙烯）	USA Scientific	1500-1211
无水乙醇
红霉素	Research Products International Corp	E57000-25.0
庆大霉素试剂溶液	Gibco	15750-060
葡萄糖（无水右旋糖）	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
硫酸卡那霉素	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0

螺旋体细菌中噬菌体介导的基因递送

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