从细菌裂解液中纯化噬菌体

摘要

来源： Pett, N., 等T4 噬菌体和 E. coli 小鼠肠道中的相互作用：研究宿主-噬菌体动态的典型模型 体内. 视频实验杂志 (2024)

本视频展示了利用连续离心、膜过滤、氯仿抽提、离心过滤和缓冲液置换等步骤，从细菌细胞裂解液中纯化噬菌体，以获得高纯度噬菌体制剂的方法。

方案

1. 实验噬菌体裂解液的制备
   1. 在无菌聚苯乙烯或玻璃培养管（带盖）中，将 E. coli 接种于 5 mL LB 培养基中。于 37 °C 摇床以 200 rpm 震荡培养过夜，直至达到稳定期。
   2. 将过夜培养的 E. coli 培养物按 1:50 比例转接至装有 100 mL LB 培养基的玻璃锥形瓶中。于 37 °C 以 200 rpm 震荡培养，直至细菌进入对数生长早期至中期（约 1.5 小时）。
      注意：建议先绘制初始生长曲线，以确定细菌处于对数生长期时在 600 nm 处的光密度（OD₆₀₀）范围。建议使用玻璃锥形瓶进行培养，因为近期证据表明噬菌体可吸附于聚丙烯等塑料材料。
   3. 向 E. coli 转接培养物中加入 100 µL 高滴度 T4 噬菌体储备液，于 37 °C 震荡培养 3 小时，或直至新制裂解液不再浑浊。将 T4 噬菌体裂解液收集至 50 mL 锥形管中，可立即进入纯化步骤，或根据需要暂存于 4 °C，次日处理。
      注意：若噬菌体爆发量较大（表示每个复制周期释放的病毒粒子平均数量较多），则需延长细菌转接培养的孵育时间。这可在加入噬菌体前提高细菌密度。
   4. 于室温下以 4000 × g 离心 20 分钟，沉淀残留细菌及细胞碎片。使用 0.22 µm 尼龙滤膜对上清液进行过滤除菌，并将滤液转移至新的 50 mL 锥形离心管中。
   5. 向每体积过滤后的 T4 噬菌体裂解液中加入 0.1 体积的氯仿，以杀灭任何残留细菌并防止细菌生长。短暂涡旋混匀，室温孵育 10 分钟。
      注意：具脂质包膜的噬菌体对氯仿敏感，可能导致噬菌体滴度下降。如必要，可省略此步骤。
      警告：氯仿为有毒有机溶剂，吸入、摄入或经皮肤吸收均具危险性。操作时应使用通风橱及适当的个人防护装备（PPE）。使用玻璃而非聚苯乙烯移液管操作氯仿，因其与大多数塑料不相容。氯仿可置于聚丙烯锥形离心管中，但不应长期储存在塑料管中。
   6. 于室温下以 4000 × g 离心 5 分钟，使氯仿与裂解液分层。使用刻度移液管小心吸取上层裂解液层转移至新的 50 mL 锥形管中，避免扰动下层氯仿层。将氯仿废液弃入指定的有害液体废物容器中。将裂解液于 4 °C 保存，待次日进行浓缩及缓冲液置换。
   7. 使用 100 kDa 超滤离心装置浓缩噬菌体裂解液：向装置上层储液室加入 13 mL 噬菌体裂解液，于 4000 × g 离心 5 分钟，或直至大部分裂解液通过滤膜进入下层收集室。
      注意：离心结束时目标保留裂解液体积约为 2 mL。随着裂解液不断加入，滤膜上噬菌体浓度升高，离心时间可能逐渐延长。超滤离心装置设有物理限位，防止完全离干。若需继续使用滤膜，切勿使其干燥（即避免将上层储液室中的液体完全移除）。离心时间可能因噬菌体类型和滴度而异。
   8. 使用 P200 或 P1000 移液器，轻轻吹打上层储液室中剩余的约 2 mL 裂解液数次，以解除滤膜堵塞。将下层收集室中的滤液弃入废液容器，保留浓缩后的噬菌体于上层储液室中。
   9. 重复步骤 1.7–1.8，直至全部噬菌体裂解液体积均通过滤膜装置，每次离心后上层储液室中保留约 2 mL 浓缩噬菌体。
   10. 最后一次离心后，通过吹打上层储液室中剩余裂解液（约 2 mL）解除滤膜堵塞。向上层储液室加入 12 mL 氯化钠-镁（SM）缓冲液进行洗涤（缓冲液置换），于 4000 × g 离心 10 分钟，或直至大部分缓冲液通过滤膜。
   11. 弃去滤液，重复洗涤步骤（步骤 1.10）。将上层储液室中剩余的 2 mL 裂解液用 SM 缓冲液重悬至终体积 10 mL（或更少），用于长期保存。将裂解液转移至 50 mL 锥形离心管中，于 4 °C 保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 ml PES Steriflip 无菌一次性真空过滤装置	Millipore Sigma	SCGP00525
Amicon® 100kDa Ultra-15 离心过滤装置，Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® SST 管	BD Medical	365967
氯仿（含乙醇作为防腐剂，符合 ACS 认证标准）	Fisher	C298-500
MaxQ 6000 恒温摇床	Thermo Scientific	8354-30-0009
微生物培养基：LB 肉汤（粉末）- Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500
带锁扣盖的 2 ml 微量离心管	Fisher	14-666-315
噬菌体储备液	Carolina Biological Supply	n/a