在病毒颗粒共存条件下细胞外囊泡的分离与富集

摘要

来源：DeMarino, C.，等．远离病毒的高产量细胞外囊泡制备物的纯化．J. Vis. Exp. （2019）

该视频演示了通过密度梯度离心法将细胞外囊泡（EVs）与病毒颗粒及其他污染物分离，随后利用水凝胶纳米颗粒进行捕获和浓缩。洗涤后的组分即可用于后续富含EVs组分的鉴定。

方案

1. 细胞外囊泡（EVs）的过滤与沉淀

1. 为了从感染或转染的细胞（即细胞系和/或原代细胞）中制备培养上清液，将约10 mL处于对数生长后期的细胞在适当的培养基（如RPMI或DMEM，含10%胎牛血清[FBS]）中，于37 °C、5% CO₂条件下培养5天。
   注意：所有培养基试剂应无细胞外囊泡（EV），可直接购买（见材料表），或通过在100,000 × g条件下预先超速离心血清90分钟自制。本方案已成功应用于多种常用细胞系，包括：CEM、Jurkat、293T、U937（未感染细胞系），U1、J1.1、ACH2、HUT102、MT-2（HIV-1和HTLV-1感染细胞系），多种转染细胞，以及原代髓系细胞和T细胞（感染与未感染状态）；然而，该方案也可用于任何细胞类型，包括需要特殊培养基或培养条件的细胞。不同细胞类型的细胞密度可能需要优化。建议在培养5天后使用最高细胞密度，同时保持最低程度的细胞死亡。
2. 将培养物在3,000 × g条件下离心5分钟以沉淀细胞，并弃去沉淀。
3. 使用无菌0.22 µm滤器过滤培养上清液，并将滤液收集至洁净离心管中。
4. 向滤过的上清液中加入等体积的聚乙二醇（PEG）沉淀试剂（1:1比例），反复倒置离心管数次以确保混合均匀。
   注意：切勿涡旋震荡。
5. 将混合物于4 °C孵育过夜（O/N）。
6. 在室温（RT）下以1,500 × g离心30分钟，获得异质性的EV沉淀。
   注意：EV沉淀应呈白色或近白色。
7. 弃去去除EV后的培养上清液。
8. 将EV沉淀重悬于150–300 µL不含钙和镁的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，并置于冰上保存。

2. 密度梯度的构建

1. 将碘克沙醇密度梯度介质与1混合× PBS 配制 11 个不同的 1 mL 密度梯度组分，碘克沙醇浓度从 6% 到 18%，每份递增 1.2%，分装于不同的微量离心管中，如图所示 图1A.
2. 涡旋振荡各管以混匀。
3. 将密度梯度组分依次加入预先清洗并干燥的摆动桶式超速离心管中，顺序从组分#18开始，至组分#6结束，如图所示。 图1B.
   注意： 所有离心管应使用10%次氯酸钠溶液喷洒消毒，随后冲洗3次× 用去离子水清洗，并在上样梯度组分前用无菌去离子水进行最后一次洗涤。
4. 加入重悬的EV沉淀（300 µL）加入超速离心管中梯度层的顶部。
5. 超速离心机在 100,00 × 4 g，4 ℃ °C，90 分钟。
6. 小心地从超速离心管中移除1 mL的组分，并将每份组分转移至新的微量离心管中。

3. 使用纳米颗粒富集细胞外囊泡组分

1. 使用等体积的 NT80、NT82 和 1× PBS 制备 30% 的纳米颗粒悬液。
   注意：使用前应涡旋混合，以确保均匀性。
2. 向含有密度梯度组分的每个微量离心管中加入 30 µL 悬液，并通过移液或颠倒数次充分混匀。
3. 将含有纳米颗粒并富集细胞外囊泡（EV）的密度梯度微量离心管在 4 °C、约 20 rpm 条件下旋转过夜（O/N）。
4. 在室温下以 20,000 × g 离心 5 分钟，对密度梯度微量离心管进行离心。
5. 弃去上清液，并用 1× PBS 将 EV 沉淀洗涤两次。
   注意：纳米颗粒沉淀可在 -20 °C 冻存，或直接用于后续多种检测（如聚合酶链式反应（PCR）、Western blot、质谱分析及其他检测）。

结果

图1： 碘克沙醇密度梯度的构建。（A）用于制备各密度组分（组分编号）的碘克沙醇与PBS的相对用量。组分编号表示每种组分中所含碘克沙醇的百分比。图中从重到轻显示了各组分的相对密度及其在梯度中的位置。（B）密度组分（6.0–18）在超速离心管中的排列方式（左侧），以及三种EV群体（Exo #1、Exo #2、Exo #3）、类外泌体囊泡和蛋白复合物所在位置的示意图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CEM CD4+ 细胞	NIH 艾滋病试剂计划	117	CEM
不含 Ca 和 Mg 的 DPBS (1x)	Quality Biological	114-057-101
外泌体耗竭型胎牛血清（FBS）	Thermo Fisher Scientific	A2720801
胎牛血清	Peak Serum	PS-FB3	血清
HIV-1 感染的 U937 细胞	NIH 艾滋病试剂计划	165	U1
Nalgene 注射器滤器 0.2 µm SFCA	Thermo Scientific	723-2520
Nanotrap (NT80)	Ceres Nanosciences	CN1030	活性红 120 核心
Nanotrap (NT82)	Ceres Nanosciences	CN2010	亮蓝 F3GA 核心
Optima XE-980 超速离心机	Beckman Coulter	A94471
OptiPrep 密度梯度介质	Sigma-Aldrich	D1556-250mL	碘克沙醇
SW 41 Ti 摆桶转子	Beckman Coulter	331362
超透明离心管，14 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344059