聚乙烯亚胺介导的胚胎肾细胞转染以生产重组病毒

摘要

来源：Van Lidth de Jeude, 等. 肠类器官慢病毒转导及下游分析实验方案。 J. Vis. Exp. (2015)。

本视频演示了通过将质粒-聚乙烯亚胺复合物转染至胚胎肾细胞中，产生病毒颗粒的过程。该过程可实现病毒基因组的表达、颗粒组装，并在培养基中收集病毒。

方案

1. 转染试剂聚乙烯亚胺（PEI）的制备

1. 将约150 mg的PEI溶解于100 ml H₂O中。
2. 逐滴加入HCl并搅拌至溶液澄清，调节pH至7.4，并持续搅拌直至完全溶解。此过程可能需要10至60分钟。加水至终浓度为1 mg/ml。
3. 待溶液澄清后，将PEI溶液经无菌0.22 µm滤器过滤，并分装为每份5 ml，置于-80 °C冰箱中保存。

2. 慢病毒颗粒的制备

第1天：

1. 将HEK293T细胞以60%-80%的融合度接种于162 cm²培养瓶或大型培养皿中，培养基为细胞系培养液（DMEM，添加10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和2 mM谷氨酰胺）。

第2天：

2. 通过混合慢病毒包装载体（7 µg pVSVg；5 µg pRSV rev；13 µg pMDL）和20 µg 编码目的基因或目的shRNA（Short hairpin Ribonucleic acid）的慢病毒质粒，配制含有45 µg总质粒DNA（Deoxyribonucleic acid）的DNA转染溶液。
3. 用DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）将体积调至1 ml。
4. 将90 µl 1 mg/ml的PEI加入930 µl DMEM中，配制PEI转染溶液，并在室温下孵育5分钟。
5. 将DNA转染溶液加入PEI溶液中，涡旋振荡或反复倒置数次，室温孵育5分钟，以获得DNA转染复合物。
6. 将2 ml DNA转染溶液滴加到HEK293T细胞中，在37 °C、湿润的细胞培养孵箱中孵育4小时。
7. 4小时后更换培养基以去除PEI。添加新培养基前无需洗涤细胞。
   注意：PEI具有细胞毒性，孵育时间超过4小时可能对HEK293T细胞造成损伤。

第4天：

7. 弃去上清液，加入新鲜培养基。保留上清液（含病毒），此上清液将在步骤 2.10 中使用。
8. 将上清液转移至 15 ml 离心管中。为去除死细胞，以 500 × g 离心 5 分钟。
9. 使用 60 ml 大容量注射器将上清液通过 0.45 µm 滤器过滤。4 °C 过夜保存。

第5天：

10. 收集第二批上清液；按照步骤2.8-2.9进行离心和过滤。
11. 将步骤2.9和2.10获得的上清液合并至超速离心管中，在超速离心机中以50,000 × g离心90分钟。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乙烯亚胺	Polysciences	23966-2
DMEM 培养基	Lonza	BE12-614F
胎牛血清	Lonza	DE14-801F
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140-122
谷氨酰胺	Invitrogen	25030-024
Matrigel	BD	BD 356231
高级 DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-乙酰半胱氨酸	Sigma	A9165-1G
小鼠 EGF	Invitrogen	PMG8045
HEPES 1 M	Invitrogen	15630-056
GlutaMAX 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
聚凝胺	Sigma	107689
烟酰胺	Sigma	N0636
胰蛋白酶	Lonza	BE02-007E
嘌呤霉素	Sigma	P 7255