利用慢病毒载体将基因递送至小鼠肠道类器官

摘要

来源：Van Lidth de Jeude, J. F., 等. 肠类器官的慢病毒转导及下游分析实验方案. J. Vis. Exp. (2015)

本视频介绍了从小鼠肠道隐窝样悬浮结构类器官中进行慢病毒转导的方法。利用基底膜基质作为支架，并结合添加生长因子的培养基，引入慢病毒载体以实现稳定的基因整合

方案

类器官的慢病毒转导

第0天：

在转导前两天，将一个完整的0.95 cm²类器官孔中的类器官传代至新孔中，目标获得约50个小型类器官。对类器官进行分割（图1A、B）。
在类器官培养基中添加10 µM Chir99021和10 mM烟酰胺，以获得囊状高增殖性隐窝（图1C）。
注意：囊状隐窝在新近分割的类器官于Chir99021存在条件下培养时发育最佳。

第2天：

使用移液器反复吹打 Matrigel 和培养基，从而用 p1000 微量移液器破坏类器官混合物。将混合物转移至 15 mL 离心管中。
使用远端开口经熔融缩小的巴斯德移液器进一步破坏类器官。在 100 × g 条件下离心 5 分钟，使类器官沉淀。
注意：根据离心机的尺寸，需使用不同的离心速度。必须确定能够将破碎后的类器官从混合物中有效分离的精确离心速度。
弃去上清液，加入 500 µL 预热的 1× 胰蛋白酶（相当于 0.25% 胰蛋白酶）。将类器官重悬于胰蛋白酶中，并在 37 °C 水浴中孵育 3 分钟。
通过加入 3.5 mL 细胞系培养基 [含 10% 胎牛血清（FCS）、1% 青霉素/链霉素和谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）] 以灭活胰蛋白酶。在 500 × g 条件下离心 5 分钟。
弃去上清液，保留约 20 µL 培养基中的沉淀。将类器官连同此少量培养基转移至 48 孔板的一个孔中。
在转导培养基中加入高滴度慢病毒，重悬后继续进行步骤 3.10。当转导效率较低时使用。
注意：为实现高效转导，通常向一个类器官孔中加入 250 µL 高滴度慢病毒的一份等分试样。这相当于单次制备所收获慢病毒总量的 50%。
可选：为提高转导效率，可进行离心增强转导（spinoculation），即将含有类器官的 48 孔板置于预热至 32 °C 的离心机中，在 600 × g 条件下旋转 1 小时。
将类器官-病毒混合物放入培养箱，在 37 °C 培养箱中孵育 1 小时，以允许转导发生。
可选：为进一步提高转导效率，可在培养箱中于 37 °C 继续孵育类器官额外 3 小时。
加入 1 mL 类器官培养基，重悬类器官-病毒混合物，转移至微量离心管中，并在微量离心机中以 850 × g 离心 5 分钟，使类器官沉淀。
弃去上清液，将沉淀重悬于 20 µL 冰冷的 Matrigel 中。由于该材料在温度升高时会凝固，因此应使用经多次反复吹打冰冷 PBS 预冷的移液器吸头。
将液滴置于 48 孔板一个孔的中央，在 37 °C 培养箱中孵育 15 分钟使其凝固。
15 分钟后，小心加入 250 µL 含 10 mM 烟酰胺、10 µM Chir99021 和 10 µM Y27632 的类器官培养基。破碎后的小型类器官片段将在 24 小时内形成小型囊状类器官。

第5天：

更换培养基，并添加适当抗生素（如使用嘌呤霉素，浓度为 4 µg/mL）。

第7天：

更换为标准类器官培养基，并添加筛选抗生素。
注意： 在撤除 Chir99021 后 2-3 周内出芽过程将完成。筛选后，类器官可在不含筛选抗生素的条件下培养。

结果

图1：用于类器官转导的慢病毒制备示意图。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号
聚乙烯亚胺	Polysciences	23966-2
DMEM 培养基	Lonza	BE12-614F
胎牛血清	Lonza	DE14-801F
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140-122
谷氨酰胺	Invitrogen	25030-024
Matrigel	BD	BD 356231
高级 DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-乙酰半胱氨酸	Sigma	A9165-1G
小鼠 EGF	Invitrogen	PMG8045
HEPES 1 M	Invitrogen	15630-056
GlutaMAX 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
Polybrene	Sigma	107689
烟酰胺	Sigma	N0636
胰蛋白酶	Lonza	BE02-007E

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