用于免疫组织化学分析的慢病毒转导小鼠肠道类器官的处理

摘要

来源：Van Lidth de Jeude, J. F., 等. 肠类器官慢病毒转导及下游分析方案. J. Vis. Exp. (2015).

本视频展示了对慢病毒转导的小鼠肠道类器官进行处理以进行石蜡包埋的步骤，从而使其可用于后续的基因表达分析。

方案

1. 类器官的石蜡包埋与免疫组织化学处理

1. 在开始类器官包埋前，将一个带有可容纳直径为12 mm玻璃管孔洞的铝块放入70 °C的培养箱中预热，以保持石蜡处于液态。

2. 取一个含有完全生长的类器官的单孔，移除培养基，保留包埋的类器官完整无损。

3. 直接向孔中加入1 ml 4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS），在4 °C固定1小时至过夜。

4. 用1 ml冰冷的PBS替换多聚甲醛。可选：此步骤后可将固定的类器官在4 °C的PBS中保存最多1周。

5. 将固定的类器官重悬于1 ml PBS中，并转移至玻璃小瓶中。

6. 让类器官静置沉降至底部约1分钟，倾去PBS，替换为70%乙醇，并在其中溶解数滴伊红溶液，以便在包埋过程中可视化类器官。

7. 将类器官置于70%乙醇中室温放置。30分钟后，小心倾去70%乙醇，由于伊红染色呈现轻微粉红色，可肉眼观察到类器官。将包埋液更换为96%乙醇。

8. 重复步骤1.7，每次更换为下一种包埋液。依次使类器官经过以下溶液：70%乙醇、90%乙醇、96%乙醇、100%乙醇、100%乙醇、二甲苯、二甲苯。

9. 倾去最后一次二甲苯洗涤液，向管中倒入石蜡。立即将管放入70 °C预热的铝块中，孵育30分钟，然后更换为新鲜干净的石蜡。

10. 倒出石蜡，使用预热且开口较大的巴斯德吸管将类器官移入石蜡包埋模具中。使用本生灯保持巴斯德吸管温度。将所有类器官置于石蜡模具中一层液态石蜡内。

11. 尽可能使用预热的解剖针将所有类器官调整至石蜡模具中央位置。使用本生灯保持解剖针温度。

12. 当类器官在模具中的位置满意后，轻微冷却模具以使石蜡层凝固。

13. 在顶部倒入更多石蜡完成包埋块，并加入标准组织学包埋盒。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多聚甲醛	Sigma	252549-1L
玻璃小瓶，锥形，12 mm × 75 mm，5 ml	VWR	LSUKM12
伊红黄ish	VWR	1,159,350,025