利用双腺病毒转导检测 SMAD 信号通路激活

摘要

来源：Chen, H., et al. 利用腺病毒报告系统对体外和体内TGF-β/Smad3信号通路进行活细胞成像。 J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种利用双腺病毒感染研究乳腺癌细胞中SMAD通路激活的方法。其中一种病毒递送组成型表达的GFP基因，另一种病毒则携带受SMAD敏感型启动子调控的RFP报告基因。在TGF-β刺激下，SMAD蛋白被激活并形成复合物，从而诱导RFP表达。在活细胞中检测到两种荧光信号即表明通路已激活。

方案

1. 活单细胞中双腺病毒转导

1. 在12孔板的每个孔中接种1.0 - 1.5 × 10⁵个MDA-MB-231细胞，加入含5%胎牛血清（FBS）的500 μL达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）培养液（细胞汇合度为35%，共2孔）。
2. 用75 μL腺病毒载体Ad-CMV-GFP（滴度 = 5 × 10⁹ PFU/mL）和7.5 μL腺病毒载体Ad-CAGA12-Td-Tom（滴度 = 5 × 10¹⁰ PFU/mL）感染细胞，以获得2,500的感染复数（MOI），可实现100%的感染阳性率。
3. 腺病毒感染后，立即在每孔中加入或不加入0.25 μL转化生长因子-β（TGF-β）（储存浓度为10 mg/mL，终浓度为5 ng/μL）。
4. 将培养板置于37 °C、含10% CO₂的培养箱中孵育24小时。
5. 使用相差荧光显微镜对活细胞进行成像。绿色荧光蛋白（GFP）的激发波长为470 nm，Td-Tomato蛋白的激发波长为554 nm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	ThermoFisher	1881024	使用前于 37 °C 水浴中预热
胎牛血清	Scientifix Life	FBS500-S	使用前进行热灭活
重组人 TGF-β1	PEPROTECH	100-21	用双蒸水稀释成 10 mg/mL 的终浓度
相差荧光显微镜	OLYMPUS	IX50
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
溶液			成分
FBS-DMEM			5% 热灭活胎牛血清；10 μg/mL 青霉素；100 μg/mL 链霉素