感染人淋巴细胞中病毒核酸与蛋白质的多重荧光成像

摘要

来源：Shah, R., et al. 单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒及流感病毒感染。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了利用分支DNA杂交与免疫荧光技术，在感染的人类淋巴细胞中同时可视化HIV-1 DNA、RNA和衣壳蛋白的方法，从而实现对单个细胞内病毒复制阶段的详细分析。

方案

1. 蛋白质免疫染色：用于标记目的蛋白质

1. 弃去 PBS（磷酸盐缓冲盐水），向盖玻片中加入 200 µL 封闭缓冲液（含 0.1% v/v Tween-20 的 PBS 中加入 1% w/v BSA（牛血清白蛋白）和 10% v/v FBS（胎牛血清），即 PBST）。在室温下孵育 1 小时。
2. 弃去封闭缓冲液，加入 200 µL 用 PBST + 1% w/v BSA 稀释的一抗。在室温下孵育 1 小时。
3. 在室温下轻轻振荡，用 PBST 洗涤载玻片两次，每次 10 分钟。
4. 在 PBST + 1% w/v BSA 中加入适量的二抗，在室温下孵育 1 小时。
5. 在室温下轻轻振荡，用 PBST 洗涤载玻片 10 分钟。

2. 细胞核染色：免疫染色后对细胞核进行复染

1. 弃去 PBST，加入 DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚) 或选用的核染料，在室温下孵育 1 分钟。
2. 用 PBS 洗涤载玻片两次，每次 10 分钟，室温下摇动洗涤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗HCV NS5a抗体	Abcam	ab13833	小鼠单克隆抗体；适用于HCV基因型1a、1b、3和4
抗HIV-1 p24单克隆抗体	NIH AIDS试剂项目	3537
抗Mov10抗体	Abcam	ab80613	兔多克隆抗体
牛血清白蛋白			免疫染色封闭试剂
含补充物的细胞培养基			适用于细胞模型的培养基
盖玻片
DAPI	ACD Bio		核染料（来自ACD Bio的RNAscope试剂盒）
杜氏磷酸盐缓冲液（1X PBS）	Gibco	14190250	不含钙和镁
胎牛血清（FBS）			根据二抗所用血清来源选择相应的FBS（例如山羊FBS）
Fisherbrand Colorfrost Plus显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	预清洁
载玻片
Tween-20			用于DNA杂交缓冲液和PBS-T