利用病毒-Cas9系统在体外建立小鼠肿瘤细胞系

摘要

来源：Prasad, M. et al. 利用腺相关病毒-Cas9系统体外建立基因工程小鼠头颈部癌细胞系。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了通过病毒递送Cre重组酶和诱导突变组分实现小鼠上皮细胞的体外转化。视频概述了Cas9激活、癌基因修饰以及致瘤性小鼠细胞系建立的各个步骤。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。 

1. 腺相关病毒（AAV）的制备

1. 第1天：细胞培养
   1. 接种 4 x 10⁶ 每14.5 cm培养皿中加入15 mL含人胚胎肾293T（HEK293T）细胞的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。准备10个培养皿用于聚乙烯亚胺（PEI）（1 µg/µL）转染。
2. 第2天：使用PEI转染HEK293T细胞
   1. 移除培养基，并在转染前1小时更换为预热的DMEM。
   2. 预热转染试剂和DMEM。
   3. 使用10 µg含AAV反向末端重复序列的感兴趣质粒（AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR）、10 µg AAV 2/9n衣壳质粒（含AAV2的rep基因和AAV9的cap基因）以及每孔10 µg辅助质粒（pAdDelta F5 helper）（参见 材料表).
      注意： 新一代辅助质粒——pAdDeltaF6 也可用于AAV生产的方案已有提供。
   4. 将质粒混合于每孔1 mL的普通DMEM中。然后向质粒混合物中加入90 µL聚乙烯亚胺（总质粒：PEI浓度 = 1:3），短暂涡旋混匀。
   5. 室温下孵育PEI-质粒DNA混合物20分钟。
   6. 将混合液逐滴加至 HEK293T 细胞表面，随后将培养板转移至 37 °C、含 5% CO₂ 的细胞培养孵箱中₂ 24 小时。
3. 第3天：转染后更换培养基
   1. 完全移除培养基，加入15 mL新鲜DMEM。
4. 第5天：病毒收获
   1. 制备干冰/乙醇浴。
   2. 用细胞刮刀收集细胞，并转移至50 mL离心管中（每管对应2块培养板）。
   3. 在室温下以 800 x g 离心 15 分钟。
   4. 弃去所有离心管中的上清液。仅向第一支离心管中加入裂解缓冲液（150 mM NaCl，50 mM 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl），pH = 8.5），每孔板加0.5 mL（即10个孔板共加5 mL）。重悬细胞后，将全部液体转移至下一管，依次操作直至最后一管。
   5. 将细胞悬液转移至一个新的50 mL离心管中。使用与步骤1.4.4中所述相同的转移方法，用相同体积的裂解缓冲液（每块培养板0.5 mL）洗涤离心管。
   6. 将细胞悬液在干冰/乙醇浴和37 °C水浴之间进行三轮约10分钟的冻融循环。每次解冻后短暂涡旋振荡。
   7. 如果纯化在同一天进行，设置平衡缓冲液和洗脱缓冲液（参见 表1 室温下（按配方）
   8. 每孔加入50单位的benzonase，在37 °C孵育1.5小时。
      注意： Benzonase 用于消化宿主生产细胞中的残留核酸以及细胞悬液中存在的质粒 DNA。
   9. 在 4 °C 条件下，以 3,000 x g 离心 15 分钟。
   10. 使用18 G钢针将上清液收集至注射器中，然后将溶液经0.45 µm滤膜过滤至15 mL离心管中，得到粗裂解液。
   11. 将粗裂解液在 4 °C 保存数周，直至纯化或立即进行纯化。

2. AAV 纯化

1. 第5天或之后
   1. 将平衡缓冲液和洗脱缓冲液置于室温。
   2. 用10 mL平衡缓冲液洗涤层析柱。
   3. 每块培养板加入0.5 mL肝素琼脂糖至层析柱中，然后加入平衡缓冲液（体积为肝素琼脂糖的4倍）。通过倒置层析柱混合溶液，并静置使琼脂糖沉淀。
   4. 依靠重力将平衡缓冲液从层析柱中流穿。
      注意：保留少量平衡缓冲液，防止琼脂糖干燥。
   5. 将粗裂解液上样至层析柱中，在4 °C下孵育2小时，并持续振荡。将层析柱竖直放置，使琼脂糖沉淀。
   6. 依靠重力将粗裂解液从柱中流穿。
   7. 用平衡缓冲液洗涤层析柱（体积为肝素琼脂糖的4倍）。
   8. 在层析柱下方放置一个100 kDa的离心蛋白滤器，使用洗脱缓冲液（体积为肝素琼脂糖的3倍）将病毒洗脱至滤器中。
      注意：洗脱缓冲液体积不应超过15 mL。
   9. 以3,000 × g离心约30分钟，直至滤器中剩余液体少于1 mL。
   10. 用磷酸盐缓冲液（PBS）加满滤器，以3,000 × g离心约30分钟，直至剩余液体少于1 mL。重复此步骤2次，以彻底去除盐分。
   11. 通过3,000 × g离心进一步浓缩滤器中的病毒溶液，使终体积尽可能小（小于200 µL）。
   12. 用针头和注射器吸取病毒溶液，并通过0.22 µm滤器将溶液推入收集管中。
   13. 将浓缩后的病毒颗粒分装保存。
       注意：短期保存（4 °C）时每份分装约20 µL，长期保存（-80 °C）时每份分装约5 µL。
   14. 测定病毒滴度及病毒转导效率。

3. 原代细胞的分离与培养

1. 第1天
   1. 采用CO₂窒息法或其他经IACUC批准的方案，处死一只6周龄的雄性或雌性B6;129-Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh}/J小鼠。
      注意：这些规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9基因敲入小鼠在CAG启动子驱动下，依赖Cre重组酶表达Cas9核酸内切酶和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。这些小鼠基因组中存在的上游Lox-Stop-Lox（LSL）序列可在无Cre重组酶时阻止Cas9和EGFP的表达。当与单导向RNA（sgRNA）及Cre来源共同使用时，可在体内或体外实现对单个或多个小鼠基因的编辑。
   2. 使用手术剪从小鼠尸体上解剖出舌组织。
   3. 使用手术刀将舌组织切成极小的碎片，手动解离组织。将组织碎片收集至含有4.5 mL无血清RPMI基础培养基（Roswell Park Memorial Institute medium，RPMI）的15 mL离心管中。
   4. 向组织碎片中加入三酶混合液（200 µL）（配方见表1）。
   5. 将组织与酶的混合物在37 °C孵育30分钟，每隔10分钟轻弹管壁，以促进酶解组织的解离。
   6. 加入含5%胎牛血清（FBS）的Hanks平衡盐溶液（HBSS）/PBS，终止酶反应。
   7. 将上述细胞悬液通过无菌70 µm尼龙滤网过滤，以分离分散的细胞与较大的组织碎片。
   8. 在室温下，以300 × g离心5分钟，用HBSS/PBS洗涤滤过的细胞悬液。
   9. 将沉淀重悬于培养基（含10% FBS的RPMI/DMEM）中，接种于60 mm培养皿中培养，直至形成明显的细胞克隆。
      1. 将细胞聚集体保留在含有3 mL完全培养基（含10% FBS的RPMI/DMEM）的60 mm培养皿中的滤膜上方，继续培养直至细胞克隆形成。
   10. 培养1周后，在显微镜下检查原代细胞是否存在成纤维细胞污染。使用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液在37 °C处理1分钟，去除来源于细胞聚集体和单细胞悬液的原代细胞中的成纤维细胞。
       注意：通常，来源于细胞聚集体的原代培养比单细胞悬液产生更多的细胞克隆。这些克隆来源的细胞在腺相关病毒（AAV）转导中具有更高的转导效率。

4. 原代细胞的 AAV 转导

1. 在6孔板中每孔接种2 × 10⁵个原代细胞，每孔加入2 mL完全培养基（含10% FBS的RPMI/DMEM）。
2. 次日，用含有10¹²病毒基因组/mL（10¹⁰转导单位/mL）的病毒液转导细胞，并将细胞在含病毒颗粒的培养基中于37 °C孵育48小时。
3. 移除含病毒颗粒的培养基，用完全培养基更换并继续培养AAV转导的细胞。
   注意：仅成功转导的细胞会表达绿色荧光蛋白（GFP）并开始增殖；未成功转导的细胞将在两周内逐渐死亡。

表1：本研究中所用缓冲液的配方

用于病毒收获的细胞裂解缓冲液	体积
150 mM NaCl	876.6mg
50 mM Tris-HCl	605.7mg
使用 HCl 调节 pH 至 8.5
分子生物学级水	加至 100 mL
平衡缓冲液
1 mM MgCl2	9.52 mg
2.5 mM KCl	18.64mg
将所有成分溶于 1X PBS 中，并调节 pH 至 7.2	加至 100 mL
洗脱缓冲液
0.5 M NaCl	2.92g
将所有成分溶于 1X PBS 中，并调节 pH 至 7.2	加至 100 mL
10X 三酶储存液：
胶原酶	终浓度 1 g [10 mg/ml]
透明质酸酶	100 mg [1 mg/ml]
DNase	终浓度 20,000 单位 [200 mg/ml]
1X PBS	加至 100 mL
质粒混合物（用于一个 14.5 cm 培养皿）
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53-KRAS HDR	10µg
AAV 2/9 衣壳载体	10µg
pAD Delta F5 辅助质粒	10µg
PEI（1µg/µl 储存液）	90µl
DMEM	1 mL

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞系
HEK93T	ATCC	CRL-3216
培养基、化学药品与试剂
DMEM	以色列比奥工业贝特海姆克有限公司	01-055-1A
FBS	以色列比奥工业有限公司	04-127-1A
HBSS	Sigma	H6648
肝素-琼脂糖	Sigma	H6508
NaCl	Bio Lab Ltd	1903059100
PBS	以色列比奥工业贝特海姆克有限公司	02-023-1A
Tris缓冲液	默克密理博	648311-1KG
PEI	Polysciences	23966-1
酶
Benzonase	Sigma	E1014
胶原酶IV	赛默飞世尔科技	17104019
DNA酶	赛默飞世尔科技	18047019
透明质酸酶	MilliporeSigma	H3506
胰蛋白酶	以色列Biological Industries Beit-Haemek有限公司	03-050-1B
小鼠品系
B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J	杰克逊实验室	24857
质粒
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR	麻省理工学院-哈佛大学布罗德研究所		美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院与哈佛大学博德研究所 Randall J Platt 博士和 Joseph Rosenbluh 博士惠赠
AAV 2/9 衣壳载体	Addgene	112865
pAD Delta F5 辅助质粒	内盖夫本古里安大学		由以色列内盖夫本-古里安大学健康科学学院生理与细胞生物学系及兹洛托夫斯基神经科学中心Daniel Gitler博士提供，贝尔谢巴 84105
塑料器皿
Amicon-ULTRA 100 KDa 滤膜	Millipore	UFC910024
0.22 µm 无菌滤器，4 mm	Millex	SLGV004SL
0.45 µm 无菌滤器，13 mm	Millex	SLHV013SL
培养皿	Greiner Bio-One
Falcon 管	Greiner Bio-One