来源：Mackler, R. M.，等．原型泡沫病毒整合体的组装与纯化．J. Vis. Exp. （2018）
本视频展示了利用盐提取和尺寸排阻色谱法从混合的蛋白质-DNA 悬浮液中纯化原型泡沫病毒（PFV）整合体，以获得可用于下游分析的活性复合物。
方法文章
通过尺寸排阻色谱法纯化原型泡沫病毒整合体
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2026年8月31日
本文内容
摘要
方案
1. 整合体溶解
- 通过在洁净表面上使用新的剃刀或手术刀片从200 µL吸头末端切去2-4 mm，制备两个宽口移液吸头。 200 µL 在干净的表面上使用新的剃刀或手术刀片从移液 tip 末端切去 2-4 mm
注意： 这些移液吸头将用于步骤1.3和1.5。 - 将透析管从透析缓冲液中取出。为防止夹子附近管末端残留的透析缓冲液稀释整合体样品，使用带有细小吸头的微量移液器除去多余的透析缓冲液。移去透析管一端的夹子。
- 使用第1.1步中的宽口移液吸头将透析袋内的样品连同沉淀物一起转移至冰上的1.5 mL离心管中。
注意： 回收材料的总体积通常约为 ~140 µL. - 样品中含沉淀物，NaCl 浓度为 200 mM；通过加入适量体积的 5 M NaCl 储存液，将盐浓度提高至终浓度 320 mM NaCl。例如，对于 150 µL 的样品，加入 3.9 µL 5 M NaCl 和 1.1 µL ddH2O，终体积为 155 µL。 150 µL，加入 3.9 µL 5 M NaCl 和 1.1 µL ddH2以获得最终体积 155 µL将装有样品的冰桶转移至4 °C冷室。 ˚4 °C 冷室
- 使用步骤1.1中的宽口移液吸头通过移液操作重悬并溶解沉淀物。每20分钟重复一次，持续至少1小时。观察大部分沉淀物应进入溶液。
注意： 当明显观察到沉淀物在不同时间点之间不再显著减少时，可停止通过移液重悬沉淀物的操作。当病毒DNA（vDNA）未标记或为内部标记时，沉淀物的量目视减少约90%。若vDNA为Cy5末端标记，则沉淀物仅减少约20%；大多数带有荧光团末端标记vDNA的沉淀物无法溶解。实际溶解的沉淀物量存在差异，需通过实验经验确定。
2. 整合体纯化
- 配制 250 mL 分子筛层析（SEC）运行缓冲液（20 mM Bis-tris 丙烷，pH 7.5，320 mM NaCl，10% 甘油）。使用 0.2-µm 滤器单元对缓冲液进行无菌过滤，并于 4 °C 保存。µm 滤器并置于 4 ˚C.
注意： 所有纯化步骤均在 4 ˚4 °C 冷房 - 平衡交联琼脂糖尺寸排阻色谱柱（SEC柱）（直径 = 10 mm；长度 = 300 mm；柱床体积 = 24 mL；上样体积 = 25 - 500 µL；最大压力 = 1.5 MPa；排阻极限 = 4 × 107 Da；可分离分子量介于5至5,000 kDa之间的物质，参见材料表）中，以0.4 mL/min的流速用SEC运行缓冲液进行平衡。
注意： 该纯化方法可适用于其他能够有效分离300 kDa与44 kDa组分的凝胶过滤层析柱，例如Superose 12 10/300 GL或Superose 6 Increase。Superose 12 10/300 GL分辨率较低，导致峰重叠更明显；而Superose 6 Increase分辨率更高，可实现更佳的分离效果。 - 在4 °C条件下，将整合体样品于微量离心机中以14,000 × g离心10分钟 ˚C，以沉淀任何残留的沉淀物。小心移除上清液。将上清液转移至一个 200 µL 进样环（可容纳约 ~200 μL将样品上样至SEC柱。
注意： 较小的上样体积可提高尺寸排阻色谱的分辨率。 - 用 25 mL SEC 流动相缓冲液洗脱，并收集 95 份 270 µL 的组分 270 µL. 观察到SEC色谱图显示三个A280/A260 峰 （图1）.
注意： 第一个峰为聚集体（洗脱体积约 9.0–11.5 mL），随后是 PFV 四聚体整合体峰（洗脱体积约 12.0–14.75 mL）以及 PFV IN 单体与游离 vDNA 峰（洗脱体积约 15.0–18.0 mL）。
结果
图1：尺寸排阻色谱图。 使用琼脂糖SEC色谱柱分离PFV整合体复合物。该色谱柱可实现聚集体（1）、由PFV IN四聚体与两条vDNA组成的PFV整合体（2）、以及单体PFV IN与vDNA（3）的分离。本示例中的vDNA含有内部标记的Cy5荧光染料，通过650 nm激发检测。纵轴表示光密度（OD），单位为毫吸光度单位（mAU）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DNA 寡核苷酸 | IDT | N/A | 定制DNA寡核苷酸 |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| BIS-TRIS丙烷>≥99.0%（滴定法） | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| 甘油 | 赛默飞世尔科技 | G37-20 | |
| 加样枪头，1 - 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| 剃刀刀片；单刃；100片/包；每包100片 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 透析袋夹子 | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm 透析管 | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 |
