用于实时定量聚合酶链式反应（qPCR）分析的病毒RNA提取

摘要

来源：Suzuki, Y., et al. 利用实时定量聚合酶链式反应检测感染细胞培养上清液中的登革病毒RNA。 J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了为定量 PCR（聚合酶链式反应）分析制备病毒样本的步骤。病毒样本和 RNA 标准品经过连续稀释后，用蛋白酶 K 缓冲液处理，并在受控温度下孵育以释放 RNA。处理后的 RNA 随即被稳定化并储存，用于病毒 RNA 水平的定量分析。

方案

1. 用于RT-qPCR（实时定量聚合酶链式反应）的病毒样本处理

注意：步骤 1.1–1.3 必须在生物安全柜内进行。特别是，含有传染性病毒的培养上清液的操作必须在生物安全二级（或更高级别）环境中进行。

1. 混合 199 μL 加工缓冲液 1 μL 无核酸酶的蛋白酶K。
2. 将合成的DENV（登革病毒）3’UTR（非翻译区）RNA（核糖核酸）用细胞培养基（例如添加10%胎牛血清和抗生素的DMEM（杜氏改良伊格尔培养基）[DMEM/10%胎牛血清]）连续10倍梯度稀释，该培养基中含有40单位/毫升RNase抑制剂，以获得5 × 10⁹至5 × 10³拷贝/微升的RNA标准品。⁹ 至 5 × 10³ 拷贝/μL 使用含有40单位/毫升RNase抑制剂的细胞培养基（例如添加10%胎牛血清和抗生素的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）[DMEM/10%胎牛血清]）对合成的DENV（登革病毒）3’UTR（非翻译区）RNA（核糖核酸）进行连续10倍稀释，以获得5 × 10⁹至5 × 10³拷贝/微升的RNA标准品。
3. 混合 5 μL 登革病毒感染细胞的培养上清液和登革病毒3'非翻译区RNA标准品与 5 μL 使用8联管PCR（聚合酶链式反应）条带或96孔PCR板，将5 μL登革病毒感染细胞的培养上清液和登革病毒3'非翻译区RNA标准品分别与5 μL处理缓冲液/蛋白酶K溶液混合。作为无模板对照（NTC），将5 μL细胞培养基（即不含病毒）与5 μL处理缓冲液/蛋白酶K溶液混合 5 μL 细胞培养基（即不含病毒）与 5 μL 的处理缓冲液/蛋白酶K溶液。
4. 短暂离心后，将样品置于热循环仪中孵育，条件如下：1个循环（25 °C孵育10分钟，75 °C孵育5分钟）。 25 °C 10 分钟 75 °C 5分钟。
注意： 处理后的样本若在同一天进行实时PCR分析，可保存于4 °C；如需长期保存，应置于-80 °C。 4 °C 如果当天进行实时PCR分析。对于长期保存，样品应储存于-80 °C。80 °C.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
简化型热循环仪（SimpliAmp Thermal Cycler）	Thermo Fisher Scientific	A24811	可使用性能相当的热循环仪，但需优化PCR循环条件。
重组RNase抑制剂（Recombinant RNase Inhibitor）	Takara Bio. Inc	2313A	40 units/μL
RNeasy Mini试剂盒（RNeasy Mini Kit）	Qiagen	74104	可使用性能相当的RNA纯化试剂盒。
蛋白酶K（Proteinase K）	Nacalai Tesque	15679-06	>600 units/mL。可使用性能相当的试剂。
MicroAmp快速光学96孔反应板，0.1 mL（MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL）	Thermo Fisher Scientific	4346907	可根据实时PCR仪器选择性能相当的反应板或管，但需优化PCR循环条件。