从人肝癌细胞中收获戊型肝炎病毒颗粒

摘要

本视频演示了从转染的人肝细胞癌细胞中分离戊型肝炎病毒（HEV）颗粒的过程。细胞外病毒颗粒从过滤后的上清液中收集，而细胞内病毒颗粒则通过反复冻融细胞释放。裂解物经离心处理后，含有HEV颗粒的上清液被分装并储存在超低温条件下，以供后续使用。

1. 细胞培养来源的戊型肝炎病毒（HEVcc）生产用 HepG2 细胞的准备
注意： 为避免污染，细胞准备、电穿孔、感染、收获及细胞固定均在生物安全二级设施中无菌条件下进行。涉及细胞的 37 °C 培养步骤均在含 5% CO₂ 的培养箱中完成。

为准备用于HEVcc生产的HepG2细胞（图1），将细胞接种于含完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）（见表1）的15 cm胶原（见表1，使用前通过0.2 µm滤膜将无菌过滤的磷酸盐缓冲盐水（PBS）-乙酸混合液加入胶原）包被的培养皿中。于37 °C孵育，直至细胞融合度达到90%。
注意：每个含有90%融合细胞的15 cm培养皿可提供足够进行最多4次电穿孔的细胞量。
轻柔吸去培养皿中的培养基，并用10 mL 1×PBS洗涤细胞一次。加入3 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA进行消化，37 °C孵育至细胞完全脱落。用10 mL完全DMEM培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至50 mL离心管中，测定细胞总数。
由于每次电穿孔需要5 × 10⁶个细胞，因此将相应体积的细胞悬液转移至新的50 mL离心管中，并用1×PBS补足体积至至少35 mL。在200 × g条件下离心5分钟，小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。
再次用35 mL 1×PBS在200 × g条件下洗涤细胞5分钟。将细胞置于冰上，暂不移除1×PBS，以保持细胞处于悬浮状态。

2. HepG2 细胞的电穿孔

进行HepG2细胞电穿孔时（图2），每次电穿孔需配制400 µL完全Cytomix溶液，即在384 µL Cytomix（见表1）中加入2 mM ATP和5 mM谷胱甘肽。使用前新鲜配制，并立即置于冰上。
注意：以下步骤的正确且快速操作至关重要，因此请确保所有准备工作均已就绪。
小心移除第4.4步中的1×PBS，避免扰动细胞沉淀。将5 × 10⁶个细胞重悬于400 µL完全Cytomix溶液中，并加入5 µg RNA。将混合液转移至4 mm电穿孔杯中，使用电穿孔仪以975 µF、270 V脉冲20 ms进行一次电击。
1. 电穿孔后，尽快用巴氏吸管将细胞转移至每份11 mL完全DMEM培养基中。
  注意：为确认RNA成功转染HepG2细胞，将进行转染对照（TC）实验。预期转染效率为ORF2阳性细胞占40–60%。
将10 mL电穿孔后的细胞转移至经胶原蛋白包被的10 cm培养皿中。另取300 µL含1.3 × 10⁵个电穿孔细胞接种于胶原蛋白包被的24孔板的一个孔内（孔中预置盖玻片，后续用于转染对照）。轻柔混匀使细胞分布均匀，于37 °C孵育。
1. 24小时后，更换10 cm培养皿中的培养基，加入10 mL新鲜完全DMEM。转染对照孔内的培养基不更换。继续在37 °C孵育6天。

3. 收获细胞内和细胞外的细胞培养来源的HEV（HEVcc）

收集细胞外HEVcc（图3）：将转染后6天的10 cm培养皿中的上清液通过0.45 µm滤膜过滤，以去除细胞碎片。如需当日感染，将收集的细胞外HEVcc储存于4 °C；否则储存于-80 °C。
收集细胞内HEVcc（图3）：用1× PBS洗涤细胞，加入1.5 mL 0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA）进行消化。37 °C孵育至细胞完全脱落，加入10 mL完全DMEM，冲洗培养皿使细胞完全脱离，并将细胞悬液转移至50 mL离心管中。用PBS洗涤细胞两次，200 × g离心5 min。
1. 弃去上清液，按每份电穿孔样品加入1.6 mL完全DMEM重悬细胞沉淀。将细胞悬液转移至2 mL反应管中。
  注意：请勿使用更大体积，否则会显著降低病毒载量。
2. 将细胞悬液在液氮中冷冻后融化，重复此冻融过程3次。
  注意：每次冻融循环中，请勿合并超过一份电穿孔样品（1.6 mL），否则会影响裂解效率。循环过程中请勿涡旋振荡细胞悬液。为最大化病毒载量，确保缓慢融化细胞悬液（例如室温或冰上融化）。
3. 将裂解后的细胞在10,000 × g高速离心10 min，以去除细胞碎片。将上清液转移至新管中。可直接用于感染；否则储存于-80 °C。
4. 可选步骤：使用浓缩装置对细胞外和细胞内HEVcc进行浓缩，以提高病毒载量。

表1：缓冲液成分表。

图1：制备HepG2细胞以进行细胞培养来源的戊型肝炎病毒（HEVcc）生产的示意图实验流程。

图2：HepG2细胞电穿孔的示意图实验装置。

图3：收获细胞内和细胞外HEVcc的示意图实验设置。