从鸡胚尿囊液中纯化病毒

摘要

来源：Yates, J. G. E., 等。从羊水制备高滴度重组新城疫病毒。J. Vis. Exp. (2022)

该视频展示了从感染病毒的鸡胚卵黄囊液中纯化和浓缩病毒颗粒的过程。实验包括一系列过滤和分离步骤，如深层过滤、切向流过滤和密度梯度超速离心，以分离完整的病毒颗粒。随后，对富含病毒的组分进行透析，通过扩散作用去除残留的盐分和梯度介质成分，再利用高渗溶液通过渗透作用进行浓缩。最终获得高滴度、高纯度的病毒制剂，适用于实验研究。

方案

1. 使用无特定病原体的鸡胚卵增殖新城疫病毒（NDV）

1. 接种无特定病原体（SPF）的鸡胚
   注意：通常使用八打SPF鸡胚生产一批适用于体内实验的新城疫病毒（NDV）。建议额外订购一至两打鸡蛋，以弥补运输过程中的破损以及孵化存活率的个体差异。
   1. 收到SPF鸡胚后，将其置于37 °C、60%湿度的孵卵器中孵化9天。确保孵卵器设置为每小时自动 rocking/旋转一次。
      注意：鸡蛋可在室温下保存最多24小时，或在4 °C下保存最多72小时；但此操作可能降低胚胎的存活率。
   2. 孵化8–11天后（理想时间为第9天），对鸡蛋进行照蛋以判断胚胎是否存活。观察是否存在网状血管系统（图1A）以及胚胎运动，作为胚胎存活的指标。丢弃无上述特征的鸡蛋（图1B）。
   3. 在存活的鸡蛋上，用铅笔标记气室与胚胎交界处，标为“X”（图1A）。确保注射位点不会刺穿血管系统。在准备接种液期间，将已标记的鸡蛋放回孵卵器。
   4. 计算接种所有SPF鸡胚所需的病毒量。确保每个鸡蛋接种100斑块形成单位（PFU）的病毒，体积为100 µL；将病毒用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至浓度为1 × 10³ PFU/mL。额外准备20%的接种液，以弥补病毒接种过程中的操作误差。
   5. 使用抗静电擦拭布，以70%乙醇中稀释的10%碘溶液清洁已标记鸡蛋的顶部。等待约1–2分钟，待溶液干燥。
   6. 使用无菌、锋利的镊子小心刺穿蛋壳。每处理一个鸡蛋后，用70%乙醇对镊子进行消毒。
   7. 使用1 mL注射器和25 G针头，将步骤1.1.4中配制的接种液100 µL注入绒毛尿囊腔（图1C）。针头应以接近90°角刺入鸡蛋，并仅插入绒毛尿囊膜顶部。
   8. 接种完成后，用指甲油封闭穿刺部位，并将鸡蛋放回孵卵器。确保在接种后24小时内保持 rocking 功能开启。
   9. 接种后24小时检查鸡蛋存活情况。丢弃绒毛尿囊膜无血管系统且无胚胎运动的死亡鸡蛋（图1B）。
      注意：这些鸡蛋的死亡是由于接种操作所致，而非由NDV引起。
   10. 将鸡蛋放回孵卵器，关闭 rocking 设置，以防止卵内蛋白污染尿囊液。
   11. 按照步骤1.1.9所述，每12–24小时检查一次鸡蛋，识别死亡个体。将接种24小时后死亡的鸡蛋转移至4°C，以减少自溶。在冷藏后2–12小时内收集尿囊液。
   12. 继续孵育鸡蛋至少72小时。
       注意：若扩增中等毒力（mesogenic）NDV毒株，最佳孵育时间为60–72小时，因为延长孵育时间会导致尿囊液浑浊度增加，从而影响后续纯化效果。此问题在扩增低毒力（lentogenic）NDV毒株时影响较小，因其杀死胚胎所需时间更长。
   13. 在适当孵育时间结束后，将剩余鸡蛋转移至4 °C，冷藏2–12小时后再收集尿囊液。
2. 收集含NDV的尿囊液
   1. 将冷藏的鸡蛋转移至生物安全柜中。用70%乙醇清洁鸡蛋顶部。
   2. 使用无菌镊子和手术剪刀打开鸡蛋顶端（即气室所在位置）。
   3. 移除蛋壳以暴露绒毛尿囊膜（图1D）。
   4. 小心刺破膜并将其剥离，以暴露尿囊腔（图1E）。确保不意外刺破卵黄囊，否则会导致样本污染。
   5. 使用钝头镊子夹住胚胎并打开胚囊。
      注意：胚囊内的液体也含有NDV。
   6. 用镊子压住胚胎，使用10 mL移液管收集尿囊液。
   7. 将收集的尿囊液置于冰上，分装至15 mL锥形管中，直至澄清处理。
      注意：若尿囊液呈黄色，表明卵黄囊已破裂，应丢弃该样本。
   8. 在4 °C条件下，以1,500 × g离心锥形管中的尿囊液10分钟。
   9. 暂停点：将澄清后的尿囊液分装至50 mL锥形管中，可长期储存于-80 °C（例如数周至数月），并补充蔗糖至终浓度5%，以保护病毒免受冻融损伤。若需短期储存（例如1–3天），可在储存前向尿囊液中添加蔗糖（终浓度5%）或3×甘露醇-赖氨酸（ML）缓冲液（15%甘露醇，3%赖氨酸），使终浓度为1×（5%甘露醇，1%赖氨酸），并储存于4 °C。

2. 从尿囊液中纯化新城疫病毒（NDV）

1. 羊水的深层过滤
   1. 将澄清的羊水在 -80 °C 下保存，并于纯化前一晚在 4 °C 下解冻。
   2. 在生物安全柜中，按照图2所示设置管路和蠕动泵。
   3. 若尚未进行，将羊水与3× ML缓冲液混合，使ML缓冲液的终浓度为1×。
   4. 在连接深层过滤器前，通过系统泵送50 mL的0.5 M氢氧化钠（NaOH）进入废液容器，以对管路进行灭菌。
   5. 通过系统泵送100 mL无菌分子级水进入废液容器，冲洗管路。
      注意：由于NaOH会灭活NDV，因此在引入含病毒的羊水前，必须充分清洗管路。
   6. 通过泵送50 mL PBS对系统进行预润，当管中剩余约5 mL PBS时停止泵送。
   7. 在管路上连接一个截留等级为1-3 µM的深层过滤器，并移除过滤器顶端侧的第二个盖子以排气。开始泵送额外的50 mL PBS通过系统。
   8. 当PBS开始从过滤器顶部的排气口流出时，关闭排气口并继续使PBS流经管路。
      注意：少量气泡可接受，但若存在大量空气，则需按照步骤2.1.7和2.1.8所述再次排气。
   9. 当管中剩余约5 mL PBS时，停止泵送。
   10. 将废液容器更换为新的无菌收集容器，并开始使羊水流经深层过滤器。
       注意：压力不应超过10 psi，否则会导致病毒剪切。可通过降低或提高泵的流速来调节压力。若压力开始超过10 psi且流速无法进一步降低，则应更换新的深层过滤器。此时，在恢复羊水流之前，应执行步骤2.1.6-2.1.8。
   11. 当所有羊水通过过滤器后，泵送50 mL的1× ML缓冲液通过管路，以最大化病毒回收。
   12. 收集液体直至管路排空。将病毒在4 °C下保存过夜或最多36小时。
       注意：一旦完成深层过滤，应在36小时内继续进行纯化过程。
   13. 断开深层过滤器，并在储存前通过系统泵送100 mL的0.5 M NaOH和42 °C预热的400 ppm次氯酸钠溶液，对管路进行消毒，随后将系统保存在0.5 M NaOH中。
2. 切向流过滤浓缩NDV
   1. 在生物安全柜中，按照图3A所示组装滤芯组件。
      注意：使用前，歧管和端板应以洗涤剂清洗并干燥。硅胶垫圈可重复使用，应与滤芯一同保存在0.5 M NaOH中。
   2. 将切向流过滤（TFF）（又称错流过滤）系统设置为“开放”构型（图3B）。
      1. 若首次使用滤芯，将TFF滤芯组装为洗脱构型，并用100 mL无菌分子级水冲洗（图3C）。
      2. 当储液罐中剩余水量约5 mL时，暂停泵送，并将TFF系统设置更改为封闭构型（图3D）。
      3. 向储液罐中加入100 mL的0.5 M NaOH和42 °C预热的400 ppm次氯酸钠溶液，并在系统中循环30-60分钟。
      4. 暂停流动，将TFF系统恢复为洗脱构型，并恢复流动以洗脱清洗液。
      5. 当储液罐中剩余约5 mL液体时，暂停泵送，并加入100 mL无菌分子级水以冲洗系统。
      6. 当储液罐中剩余约5 mL液体时，暂停泵送，并将TFF系统置于开放构型（图3B）。继续执行步骤2.2.3。
   3. 使用蠕动泵通过系统泵送100 mL的0.5 M NaOH，对滤芯和管路进行灭菌。确保压力不超过30 psi，以保持滤芯完整性。
   4. 当储液罐中剩余约5 mL的0.5 M NaOH时，暂停泵送。
   5. 向储液罐中加入100 mL无菌分子级水，并恢复液体通过滤芯的流动。轻轻摇晃储液罐，确保将所有NaOH从罐壁冲洗干净，以防止病毒失活。重复储液罐清洗步骤。
   6. 当储液罐中剩余约5 mL无菌分子级水时，暂停泵送。
   7. 向储液罐中加入100 mL PBS，轻轻摇晃以确保无菌分子级水从罐壁被冲洗干净。恢复液体通过滤芯的流动。
   8. 当储液罐中剩余约5 mL液体时，暂停泵送，将经深层过滤的羊水加入储液罐，并恢复泵送。
   9. 监控压力表1（图3B），确保其不超过10 psi，以防止病毒剪切。结合使用蠕动泵速度和C型夹具增加废液的洗脱。
      注意：结合使用蠕动泵速度和C型夹具将导致压力升高。
   10. 当储液罐中剩余50-100 mL羊水时，暂停泵送，通过加入150-200 mL的1× ML缓冲液进行缓冲液置换。
   11. 恢复泵送，再次监控压力表1（图3B），确保其不超过10 psi。
   12. 当储液罐中剩余5-10 mL液体时，暂停泵送。
   13. 使用两个C型夹具，关闭两个废液管路，如图3C所示。
   14. 断开向储液罐供液的截留液管路，并将其插入一个50 mL离心管中（图3C）。
   15. 恢复泵送，当储液罐中剩余几滴液体时暂停。
   16. 移除废液管路上的C型夹具，并将截留液进液管路重新连接至储液罐（图3B）。
   17. 加入20-25 mL的1× ML缓冲液，并恢复泵送，直至储液罐中剩余约5 mL液体。
   18. 重复步骤2.2.13至2.2.16。
       注意：可通过重复步骤2.2.17以及2.2.13至2.2.16进行第三次洗脱，以提高病毒产量。但大部分病毒存在于前两次洗脱中。
   19. 完成洗脱后，将病毒置于冰上或4 °C保存。
   20. 为清洗管路，将系统设置为闭环模式（图3D），使废液管路回流至储液罐，如图3D所示。
   21. 加入250 mL的0.5 M NaOH和42 °C预热的400 ppm次氯酸钠溶液，开始清洗系统。
   22. 让清洗液在系统中循环过夜。
       注意：在循环清洗液时，若泵以50 mL/min的速度运行，应观察到约5 psi的压力。若压力超过此值，则表明滤芯被污染，应更换清洗液并重复清洗过程。
   23. 将清洗液通过将两个废液管路和截留液管路导向废液容器进行洗脱。
   24. 向储液罐中加入400-500 mL无菌水，并使其通过系统流入废液容器。
   25. 当储液罐中剩余约5 mL液体时，暂停泵送，并向储液罐中加入100-200 mL的0.5 M NaOH，轻轻摇晃溶液以清洗储液容器。
   26. 当储液罐几乎排空后，重复步骤2.2.23两次。
   27. 拆卸TFF装置，将TFF滤芯和垫圈保存在可密封塑料袋中的少量0.5 M NaOH中，并于4 °C保存。
       注意：管路可于室温下浸没在0.5 M NaOH中保存。
3. 碘克沙醇密度梯度超速离心
   1. 开启超速离心机并设置为预冷至4 °C。同时将所需转子预冷至4 °C（见材料表）。
      注意：转子应保存在4 °C下。
   2. 使用购入时的60%碘克沙醇储备液，用PBS和3× ML缓冲液稀释，制备40%、20%和10%的碘克沙醇溶液，使ML缓冲液的终浓度为1×。
   3. 在13.2 mL开口薄壁超速离心管中，依次叠加0.5 mL、2.5 mL和2.5 mL的40%、20%和10%碘克沙醇溶液（图4A）。
      注意：将超速离心管倾斜并缓慢排出溶液，可显著降低梯度层混合的风险。各层之间应清晰分界，梯度各层间可见“光环”。
   4. 使用记号笔标记各梯度层的界面。
   5. 将TFF步骤洗脱出的6-6.5 mL病毒液小心地叠加在密度梯度上。按照步骤2.3.3所述操作，避免扰动密度梯度。
   6. 使用开口天平将超速离心管装入摆桶转子的插件中（见材料表），使各插件之间的重量差异在0.01 g以内。使用PBS或额外的病毒洗脱液调节重量差异。
   7. 管子平衡后，盖上管帽并装入转子。
   8. 在4 °C下以125,000 × g离心1.5小时。
      注意：若超速离心机具备延时启动功能，可过夜进行。
   9. 超速离心后，用无菌镊子取出离心管。寻找目标条带，即位于10%和20%梯度之间的大条带（图4B）。
   10. 使用铁架台将离心管悬置于烧杯上方。
   11. 将18 G × 1.5英寸针头连接至5 mL注射器，并刺穿超速离心管侧壁。
       注意：应在目标条带略下方刺穿管壁，针头向上倾斜且斜面朝上，使其进入目标条带。
   12. 缓慢推动活塞，移取目标条带。
       注意：在目标条带内移动针头以最大化病毒提取量。注意避免其他条带或杂质混入目标条带，并避免吸取过多溶液，以免增加透析滤芯的使用量。
   13. 目标条带提取完成后，拔出针头，让剩余溶液流入废液烧杯。将目标条带收集至50 mL离心管中，直至所有超速离心管的目标条带均被提取。
   14. 重复步骤2.3.10-2.3.13，直至从所有超速离心管中提取完所有目标条带。
   15. 提取目标条带的替代方法（如步骤2.3.10至2.3.13所述）
       1. 使用移液器缓慢移除覆盖在目标条带上的液体。到达目标条带后，用移液器提取并将其病毒保存在50 mL离心管中。
          注意：此方法可重复使用超速离心管。
4. 从病毒溶液中去除碘克沙醇
   注意：含NDV的条带出现在碘克沙醇密度为15%至16%之间。可通过测量340 nm处的吸光度并参照标准曲线确定溶液中碘克沙醇的浓度。此步骤可省略，因为在将此浓度的碘克沙醇溶液给予C57BL/6小鼠时，未观察到不良影响或急性毒性。
   1. 将0.5-3 mL、10 kDa分子量截留的透析滤芯浸入PBS中1分钟进行预润。
      注意：透析膜应从光滑变为起皱或凹凸不平。若提取病毒体积超过10 mL，应使用两个0.5-3 mL透析滤芯或一个5-12 mL透析滤芯。
   2. 根据需要，使用5或10 mL注射器和18 G × 1.5英寸钝头填充针从50 mL离心管中收集病毒。
   3. 用注射器插入透析滤芯，注意不要刺穿膜，并注入病毒。
      注意：可旋转透析滤芯以调节滤芯内气泡的位置。在从滤芯中拔出针头前应去除气泡。
   4. 在1 L烧杯中加入无菌1× PBS，放入搅拌子和透析滤芯，盖上盖子。在4 °C下轻轻搅拌孵育。
      注意：使用挤出聚苯乙烯泡沫和弹性带固定透析滤芯，使其漂浮在PBS中。滤芯可能因ML缓冲液而轻微膨胀。
   5. 1-2小时后，更换为新鲜的1× PBS，并在4 °C下继续孵育8-10小时，同时轻微搅拌。
      注意：也可过夜进行。
   6. 再次更换为新鲜的1× PBS，在室温下孵育1-2小时。
5. 病毒溶液的浓缩
   1. 从透析缓冲液中取出透析滤芯（图4C），放入一个小的可密封塑料袋中。加入15-25 mL的40% 20,000 MW聚乙二醇，使透析滤芯完全浸没。
   2. 在室温下振荡孵育。使用5或10 mL注射器和18 G × 1.5英寸钝头填充针定期检查滤芯中病毒的体积。
      注意：浓缩病毒所需时间取决于起始体积和期望终体积。通常，最终期望体积在1至1.5 mL之间，无论羊水起始体积如何。检查体积时，应避免使用同一端口，以免破坏端口完整性，导致聚乙二醇溶液与病毒混合。
   3. 在从透析滤芯中取出浓缩病毒前，用1× PBS短暂冲洗滤芯，并用空气填充18 G × 1.5英寸钝头填充针。
   4. 将充满空气的注射器插入透析滤芯并推动活塞。旋转装置，使浓缩病毒可在不移除引入空气的情况下被取出。
   5. 将浓缩病毒分装至50 mL离心管中，记录分装体积。
   6. 使用同一注射器和针头，向透析滤芯中注入适量60%蔗糖，使与先前取出的病毒混合后终浓度为5%蔗糖。
   7. 用戴手套的手指轻柔按摩膜，使可能粘附在膜上的残留病毒脱落，注意不要损坏膜。排出透析滤芯中部分多余空气以利于脱落过程。
   8. 将此洗涤液与已存在于50 mL离心管中的病毒合并。
      注意：病毒现处于5%蔗糖中，可分装为20 µL、50 µL、100 µL或200 µL等份，并在-80 °C下保存。或者，为长期保存，可按照第2.6节所述对NDV进行冻干并在4 °C下保存。

结果

图1：从无特定病原体的鸡胚中感染并收获新城疫病毒（NDV）。 （A）孵化9天后，应可见网状血管结构（箭头所示），并可观察到胚胎活动。“X”表示绒毛尿囊膜与气室之间的界面，即接种病毒时打孔的位置。（B）显示死亡胚胎的图像。注意网状血管结构缺失，且无胚胎活动。（C）鸡胚结构示意图，显示气室、卵黄囊、羊膜囊、绒毛尿囊膜及尿囊液的位置。（D）去除蛋壳以暴露绒毛尿囊膜。（E）打开绒毛尿囊膜后，尿囊液和胚胎应呈现的状态示意图。缩写：NDV = 新城疫病毒。

图2：深度过滤装置通用组装示意图。 确保压力表安装在深度过滤器的上游位置。

图3：切向流过滤装置的不同配置示意图。箭头表示流体流动方向。 （A）TFF夹具组装方式的示意图。 （B）TFF系统在“开放”配置下的示意图，该配置用于流体的纯化与浓缩过程。 （C）在洗脱病毒及清洗液时，TFF装置进行洗脱操作的示意图。 （D）TFF系统处于“封闭”配置下的示意图，该配置用于TFF系统的清洗过程。缩写：TFF = 切向流过滤。

图4：来自TFF的浓缩病毒的密度梯度超速离心及透析。（A）示意图显示碘克沙醇密度梯度的组成。（B）纯化过程中使用ML缓冲液制备的病毒经超速离心后的病毒条带模式。主要含病毒条带以黑色椭圆标示。（C）透析过程结束时，装载了10 mL经碘克沙醇梯度制备的病毒的透析盒的典型大小。缩写：TFF = 切向流过滤；ML = 甘露醇-赖氨酸。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 滑动接头注射器	BD	309659
10 mL 锁扣式注射器	BD	302995
10% 聚维酮碘溶液	LORIS	109-08
15 mL 圆锥形离心管	Thermo-Fisher	14955240
18G × 1 1/2 英寸钝头填充针	BD	305180
18G × 1 1/2 英寸精密滑动针	BD	305196
25G × 5/8 英寸针头	BD	305122
5 mL 锁扣式注射器	BD	309646
冰乙酸	Thermo-Fisher	A38-212
琼脂糖	Froggabio	A87-500G
Alexa-Fluor 488 山羊抗小鼠抗体	Invitrogen	A11001
Allegra X-14 离心机	Beckman Coulter	B08861
过硫酸铵	BioRad	161-0700
漂白剂（5%）	Thermo-Fisher	36-102-0599
宽头无齿镊	Thermo-Fisher	09-753-50
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	114405-25G
Centramate 过滤器支架	PALL	CM018V
ChemiDoc XRS+ 成像系统	BioRad	1708265
Digital 1502 Sportsman 孵化器	Berry Hill	1502W
D-甘露醇	Sigma-Aldrich	M4125-500G
照蛋灯	Berry Hill	A46
乙醇（70%）	Thermo-Fisher	BP82031GAL
尼龙材质带螺纹三通接头，1/8 英寸 NPT(F)	Cole-Parmer	06349-50
湿度套件	Berry Hill	3030
碘克沙醇	Sigma-Aldrich	D1556	水中含 60%（w/v）碘克沙醇的无菌溶液
L-赖氨酸盐酸盐	Sigma-Aldrich	62929-100G-F
1/8 英寸国家管道螺纹（NPT）公母式鲁尔锁接头	Cole-Parmer	41507-44
Masterflex L/S 数字驱动器	Cole-Parmer	RK-07522-20	带数字显示的蠕动泵
Masterflex L/S 精密管路易装泵头	Cole-Parmer	RK-07514-10
Masterflex 硅胶管（铂金固化），L/S 16	Cole-Parmer	96420-16	BioPharm 铂金固化硅胶
Omega 膜 LV Centramate 过滤器盒，100K	PALL	OS100T02
Optima XE-90 超速离心机	Beckman Coulter	A94471
PBS 10X 溶液	Thermo-Fisher	BP399-20
聚乙二醇（平均分子量 20,000）	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Slide-a-lyzer 透析盒（加强型），10,000 MWCO，0.5–3 mL	Thermo-Fisher	66380
氢氧化钠（颗粒）	Thermo-Fisher	S318-10
无特定病原体鸡蛋	CFIA	NA	供应商因地区而异
蔗糖	Thermo-Fisher	S5-3
Supracap 50 深层过滤器	PALL	SC050V100P
手术剪刀	Thermo-Fisher	08-951-5
Sw41Ti 转子	Beckman Coulter	331362	用于实验步骤 2.3.1、2.3.6、2.3.7
SX4750 转子	Beckman Coulter	369702
SxX4750 圆锥底离心管适配器	Beckman Coulter	359472
薄壁 Ultraclear 离心管（9/16 英寸 × 3 1/2 英寸）	Beckman Coulter	344059
管夹	PALL	88216
通用压力表	Cole-Parmer	68355-06