仙台病毒介导的人血细胞重编程为诱导性多能干细胞

摘要

来源：Rim, Y. A., et al. 利用仙台病毒与离心法由血细胞生成诱导性多能干细胞。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了利用仙台病毒介导的重编程技术，从人外周血单个核细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。病毒转录因子可激活多能性网络并抑制谱系特异性基因，从而使部分细胞获得黏附特性并形成iPSC克隆。该方案通过选择性基质结合和每日培养基更换，富集并维持这些重编程细胞。

方案

所有涉及样本采集的步骤均按照本机构的IRB指南进行。

1. 仙台病毒转导

1. 转导（第0天）
   1. 收集血液细胞并转移至15 ml锥形管中，用血细胞计数板进行计数。
   2. 每项转导准备3 × 10⁵个细胞，在室温（RT）下以515 × g离心5分钟。
   3. 通过抽吸弃去上清液，将细胞重悬于0.5 ml血液细胞培养基中。
   4. 将细胞转移至未包被的24孔板的一个孔中。
   5. 将仙台病毒混合物置于冰上解冻，加入悬浮细胞中；根据生产商的建议添加仙台病毒。
   6. 用封板膜密封培养板，在30 °C下以1,150 × g离心30分钟。
   7. 离心后，在37 °C、5% CO₂条件下过夜（O/N）培养细胞。
2. 细胞转移至饲养层基质（第1天）
   1. 次日，用纤连蛋白包被24孔板。将纤连蛋白溶液用PBS稀释至终浓度为5 µg/ml。向24孔板的每个孔中加入1 ml纤连蛋白溶液，在室温下孵育至少1小时。使用前移除包被液。包被后的培养板可在室温下保存3天。
   2. 将含有细胞和病毒的所有培养基转移至已包被的孔中。
   3. 用额外0.5 ml新鲜血液细胞培养基收集残留细胞，并加入含细胞的孔中。
   4. 将培养板在35 °C下以1,150 × g离心10分钟。
   5. 离心后，移除上清液，加入1 ml iPSC培养基，在37 °C、5% CO₂条件下过夜（O/N）维持培养。
3. 第二次细胞转移（第2天）
   1. 用5 µg/ml纤连蛋白包被新的24孔板的孔，操作同步骤1.2.1。每个转导使用该板的一个孔。
   2. 将细胞悬液从第一块板转移至新包被的纤连蛋白板。
      注意：若不需要，可弃去悬浮细胞。步骤2.3中所述操作可用悬浮细胞重复2–3次。若重复操作，需收集细胞。
   3. 同时，向第一块板的孔中加入1 ml iPSC（诱导性多能干细胞）培养基以维持培养，并在37 °C、5% CO₂条件下过夜（O/N）孵育。
   4. 在37 °C和5% CO₂条件下维持贴壁细胞培养，每日更换新鲜iPSC培养基。转导后第14–21天可见细胞集落形成。
   5. 将含有悬浮细胞的新包被板在35 °C下以1,150 × g离心10分钟。
   6. 离心后，在37 °C、5% CO₂条件下过夜（O/N）培养细胞。
   7. 次日，移除上清液并更换为新鲜iPSC培养基。
      注意： 步骤1.3中所述操作可用悬浮细胞重复2–3次。若需重复操作，需收集上清液中的细胞并重复步骤1.3。
   8. 通过每日更换培养基维持贴壁细胞培养，直至细胞融合度达到80%。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
塑料器皿
50 ml 离心管	SPL	50050
15 ml 离心管	SPL	50015
10 ml 一次性移液管	Falcon	7551
5 ml 一次性移液管	Falcon	7543
12 孔板	TPP	92012
24 孔板	TPP	92024
iPSC 生成与培养材料
CytoTune-iPSC Sendai 重编程试剂盒	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 培养基	STEMCELL Technologies	5940	iPSC 培养基
维通宁（Vitronectin）	Life Technologies	A14700
TrypLE express（TrypLE）	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	克隆解离溶液