使用链霉亲和素阻断法分析流感病毒的内化作用

摘要

来源：Pohl, M. O. & Stertz, S. 通过流式细胞术检测甲型流感病毒在 A549 细胞中的吸附与内化。《可视化实验杂志》（J. Vis. Exp.）(2015)

本视频展示了如何利用链霉亲和素阻断实验，区分人肺上皮细胞表面结合与内化的流感病毒。通过比较荧光信号，孵育后荧光强度更高表明病毒成功内化。

方案

1. 结合/内化实验

注意：开始实验前请确保准备好所有试剂。对于结果部分展示的三个对照组（模拟感染细胞、神经氨酸酶预处理细胞和叠氮化钠处理细胞），需对实验方案进行少量调整。

1. 准备16个深孔管，每管含有200,000个A549细胞。除由4个管组成的实验组外，还有3种对照条件，每种需要4个管：模拟感染细胞、神经氨酸酶（NA）预处理细胞和叠氮化钠处理细胞。每组包含4个标记为“0分钟”、“0分钟+链霉亲和素（STV）”、“30分钟”、“30分钟+STV”的管。
2. 在4°C下以450 × g离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µl磷酸盐缓冲液（PBS）中。
3. 在4°C下以450 × g离心。弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µl含0.3%牛血清白蛋白（BSA）、20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）（孵育培养基）中。在37°C孵育30分钟。
   注意：对于神经氨酸酶对照：使用细菌神经氨酸酶（例如来自Vibrio cholera的唾液酸酶），以200 mU/ml的浓度溶于孵育培养基中重悬细胞。
4. 在4°C下以450 × g离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µl PBS中。重复此步骤一次，然后将管置于冰上冷却10分钟。
5. 在4°C下以450 × g离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于100 µl生物素标记的病毒中（使用第2节确定的病毒浓度，溶于感染用PBS中）。在冰上孵育1小时。
6. 在4°C下以450 × g离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µl PBS中。重复此步骤一次。
   注意：对于模拟感染对照：使用不含病毒的感染用PBS。对于叠氮化钠对照：使用溶于含0.1%叠氮化钠的感染用PBS中的病毒。
7. 冰上感染后的样品处理：
   1. 对于“0分钟”样品，执行步骤2.5，并将样品在4°C保存，直至其他样品完成固定。
   2. 对于“0分钟+STV”样品，在4°C下以450 × g离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于50 µl STV中（使用第3节确定的浓度，溶于含2% BSA和0.1%叠氮化钠的PBS中，以防止在样品处理过程中发生内化）。在冰上孵育30分钟。
   3. 在4°C下以450 × g离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µl PBS中。重复此步骤一次。
   4. 固定时，在4°C下以450 × g离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于100 µl 3.7%多聚甲醛（PFA）中。在室温孵育10分钟。然后重复步骤1.6中描述的洗涤步骤，并将样品在4°C保存。
   5. 对于“30分钟”样品，在4°C下以450 × g离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于含2% BSA的200 µl PBS中。在37°C孵育30分钟。执行步骤1.7.3–1.7.4，并将样品在4°C保存。
      注意：对于叠氮化钠对照：在37°C孵育30分钟时，使用含2% BSA和0.1%叠氮化钠的PBS。
   6. 对于“30分钟+STV”样品，在4°C下以450 × g离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于含2% BSA的200 µl PBS中。在37°C孵育30分钟。然后在4°C下以450 × g离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于50 µl STV中（使用第3节确定的浓度，溶于含2% BSA和0.1%叠氮化钠的PBS中，以防止在样品处理过程中发生内化）。在冰上孵育30分钟。执行步骤1.7.3–1.7.4，并将样品在4°C保存。
      注意：对于叠氮化钠对照：在37°C孵育30分钟时，使用含2% BSA和0.1%叠氮化钠的PBS。
8. 进行通透处理时，在4°C下以450 × g离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于含0.5% Triton X-100的100 µl PBS中。在室温孵育6分钟。然后重复步骤1.6中描述的洗涤步骤。
9. 在4°C下以450 × g离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于50 µl含STV-Cy3的2% BSA PBS溶液中。（请注意，应在实验开始前确定STV-Cy3的合适浓度。建议从1:200开始，进行2倍梯度稀释至1:2,400进行测试。在我们的实验中，1:1,000的稀释度效果最佳。）
10. 在室温避光孵育1小时。然后重复步骤1.6中的洗涤步骤，但将沉淀重悬于200 µl含2% BSA的PBS溶液中。
11. 通过流式细胞术分析样品。确定各样品中Cy3阳性细胞的百分比。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Life Technologies	41966-052
FBS	Life Technologies	10270-106
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-蔗糖	Fluka	84100
Bio Rad 蛋白定量试剂盒	Bio Rad	500-0006
深孔管（1.2 ml 微量管）	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem Electron microscopy sciences	15710
超速离心管	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
叠氮化钠	Fluka	71290
细菌神经氨酸酶/唾液酸酶	Sigma-Aldrich	N6514-1UN