利用光学密度测定评估噬菌体介导的细菌生长抑制

摘要

本视频演示了一种基于微孔板的检测方法，用于评估噬菌体混合物对大肠杆菌（E. coli）细菌培养物的裂解活性。该方法重点展示了光密度的变化如何揭示噬菌体的效力以及实现完全抑制细菌生长所需的浓度。

1. 缓冲液和试剂的准备

制备500 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）（15 g TSB粉末与500 mL超纯水），并进行高压灭菌。
注意： 可在室温下保存最长3个月，或在4 °C下保存最长6个月。
制备500 mL胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）（20 g TSA粉末与500 mL超纯水），并进行高压灭菌。
注意： 可在4 °C下保存最长3个月。
制备500 mL磷酸盐缓冲液（PBS；4 g NaCl、0.1 g KCl、0.77 g Na₂HPO₄、0.12 g KH₂PO₄，加超纯水至500 mL），在25 °C下测定并调节pH至7.2 ± 0.2，然后高压灭菌。
注意： 可在4 °C下保存最长6个月。
制备200 mL 1 M MgSO₄溶液（49.294 g溶于200 mL超纯水），通过0.22 µm聚醚砜滤膜过滤除菌。
制备500 mL含10 mM MgSO₄的TSB培养基（mTSB；15 g TSB粉末、500 mL超纯水和5 mL 1 M MgSO₄），高压灭菌后冷却至室温。采用无菌操作技术，使用移液管小心加入5.0 mL 1 M MgSO₄，轻轻摇动混匀。

2. 细菌培养物的制备

为制备细菌研究实验室培养物（BRLC），从冷冻库中取出甘油保存管并转移至实验室。
使用一次性接种环或等效工具，插入小瓶中，取出少量接种物（冻结的冰状物），在II级生物安全柜内划线接种于TSA平板或等效培养基上。将平板置于37 °C培养 ± 2 °C 15−18 小时
将制备好的 BRLC 平板装入袋中并储存于 4 °C.
注意： BRLC的一般保质期：14天，保存于 4 °C 代次生成后。
接种每种菌株的单个菌落 大肠杆菌 从BRLC平板上挑取O157菌株接种于10 mL TSB中，静置培养 37 °C 培养18小时，至菌液浓度达到9 log10 CFU/mL。
制备过夜培养物的系列稀释液（次日早晨），每种 E. coli 使用含 10 mM MgSO₄ 的 mTSB 培养 O157 菌株₄ 以达到 4-5 log10 CFU/ml（或其他所需接种量水平）。
将每种菌株的过夜培养物等体积混合，使总菌浓度达到 4-5 log10 CFU/mL（或按所需浓度），以制备细菌混合液。
立即将稀释后的细菌培养物置于 4 °C 以备后续使用。
将接种菌液稀释10倍或100倍，取0.1 mL稀释液涂布于TSA平板，以获得单菌落。

3. 噬菌体工作液的制备

按照标准方法4扩增每种待筛选噬菌体的高滴度工作菌种（≥108 PFU/mL）。
注意：噬菌体菌种在4 °C塑料瓶中保存的一般有效期为制备后3个月。
为达到裂解动力学实验所需的滴度（例如，约10⁸ PFU/mL），用含有10 mM MgSO₄的mTSB稀释各噬菌体原液。将相同滴度的各工作菌种等体积混合，制备所有可能组合的噬菌体混合物。

4. 准备 体外 单个噬菌体及噬菌体鸡尾酒的裂解动力学

在无菌96孔微板的第1至第8列中，对每种噬菌体进行连续10倍稀释，以建立微孔板检测体系。
注意： 每块微孔板上可对四种噬菌体针对一种细菌菌株进行测试，每种设两个复孔，位于相邻的列中。其余四列为对照组，包括不含噬菌体的对照以及mTSB空白对照。图1).
放置 180 µL 96孔微孔板第1至第12列各孔中的mTSB
添加 20 µL 向微量滴定板顶行（A行）的1-8号孔中加入稀释后的单一种类噬菌体或噬菌体混合液（约108 PFU/mL）。
对于无噬菌体和空白对照组，添加 20 µL 向第9、10和11列的最上方孔中加入mTSB。
使用12通道移液器稀释该培养板。转移 20 µL 从一行到另一行。通过轻柔地重复吸液和排液（至少五次），并在每次稀释之间更换吸头，充分混匀各孔中的内容物。移除 20 µL 从最后一行（H 行）。
注意： 建议使用带滤芯的吸头，以防止交叉污染。
为每种菌株设置一个储液槽。使用1 mL移液器将2–3 mL稀释后的菌液转移至储液槽中。对于第1–10列，使用多通道移液器加入 20 µL 将稀释后的细菌培养物加入各孔中。每次加样后更换吸头。
盖好微孔板并在设定条件下孵育（例如， 37 °C 10 小时 22 °C 22 小时。
在2小时或其他预定时间间隔，将微孔板从培养箱中取出。

图1： 96孔微孔板实验的建议布局。每种噬菌体的连续10倍稀释液在无菌96孔微孔板的第1至第8列中制备。每块板上可相邻列中以复孔形式同时检测四种噬菌体对一种细菌菌株的作用。其余列用于对照。