用于普遍性转导的噬菌体裂解液的制备

摘要

来源： Saragliadis, A., 等. 利用可切除抗生素抗性盒通过P1转导在Escherichia coli中实现基因缺失。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了含有转导颗粒的噬菌体裂解液的制备过程。感染供体菌株后形成噬菌斑，通过氯仿处理软琼脂覆盖层，获得澄清的裂解液用于后续分析。

方案

1. 供体菌株的感染
   1. 将供体菌株 JW4197 接种于 5 mL 添加了 10 mM CaCl₂ 并可选添加卡那霉素（Kan，25 µg/mL）的溶菌肉汤（LB）培养基中，培养至 600 nm 处的光密度（OD₆₀₀）约为 1.0。使用分光光度计测定 OD₆₀₀ 值。
   2. 用 LB 培养基对现有的 P1 噬菌体储备液进行系列稀释：推荐稀释倍数为 10^-3 至 10^-7。
   3. 在 15 mL 离心管或同等容器中，混合 200 μL 细菌悬液与 100 μL 特定稀释度的噬菌体溶液。根据噬菌体稀释度的数量准备相应数量的离心管。于 37 °C 静置孵育 20 分钟。
   4. 向各管中加入约 3 mL 熔化的顶层琼脂（约 50 °C），其中添加 10 mM CaCl₂，短暂涡旋混匀，然后将混合物倒入预热的 LB 平板上，形成均匀薄层。
   5. 将平板于 37 °C 过夜培养。
2. 裂解液制备
   1. 次日选择噬菌斑呈半融合生长的平板。在半融合平板上，约一半的平板表面区域呈透明状（图 1）。
   2. 使用接种环或类似工具刮取该平板上的顶层琼脂层，并将琼脂转移至离心管中。加入 1–2 mL LB 培养基和一滴氯仿，剧烈涡旋振荡约 1 分钟。在通风橱中加入氯仿。
   3. 以 4,000 x g 或更高速度离心 15 分钟，使琼脂和细菌细胞沉淀。
   4. 将上清液转移至新的微量离心管中，避免带入沉淀中的残渣。加入两滴氯仿，并将裂解液保存于 4–10 °C。在通风橱中加入氯仿。切勿冷冻噬菌体裂解液，否则会导致感染性颗粒数量显著下降。

结果

图1：P1感染后的平板示例。(A) 本图显示含有单个噬菌斑的平板。(B) 本图显示半融合的平板。(C) 本图显示过度感染的平板，其中几乎所有细菌均已被噬菌体裂解。一些抗性菌落从顶层琼脂中生长出来。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
菌株
E. coli JW4179	NIG	JW4179-KC	tamA 缺失突变体
P1 vir	NIG	HR16	通用转导噬菌体
琼脂	BD Bacto	214010
氯化钙	Merck	102382
氯仿	Merck	102445