检测感染细胞中丙型肝炎病毒复制复合体的免疫荧光实验

摘要

来源：Ren, S., et al. 丙型肝炎病毒复制分析方案. J. Vis. Exp. (2014).

本视频展示了一种基于免疫荧光的方法，用于检测感染性肝癌细胞中丙型肝炎病毒的复制。该方案包括细胞固定、针对病毒蛋白和双链RNA的抗体染色，以及使用荧光标记的二抗进行可视化。在荧光显微镜下观察到双重信号，可确认病毒在宿主细胞内处于活跃复制状态。

方案

1. 免疫荧光检测（IFA）

1. 在 -20 ºC 条件下使用甲醇固定丙型肝炎病毒（HCV）感染和转染的细胞 30 分钟，用于免疫荧光检测。

2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次，并用 IFA 封闭缓冲液进行封闭。

3. 使用兔多克隆抗 NS5A 一抗或鼠单克隆抗双链 RNA（dsRNA）抗体 J2，按 1:200 稀释（1 μg/ml），在 4 ºC 孵育 5 小时至过夜。

4. 一抗孵育后，用 PBS 洗涤细胞三次。

5. 加入山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）-488 多克隆二抗或山羊抗鼠 IgG-594 多克隆二抗，按 1:1,000 稀释（1 μg/ml），室温孵育 1 小时。

6. 用 PBS 洗涤细胞三次，使用 Hoechst 染料对细胞核染色，并用荧光显微镜观察（图 1D）。

结果

图1. HCV 构建体生长表型的评估。 A）评估野生型（WT）和聚合酶缺失型（Pol-）病毒的基因组复制动力学。柱状图显示了通过RT-qPCR检测的正义RNA链的基因组拷贝数。Pol-病毒的基因组拷贝数随时间推移而下降，表明其具有复制缺陷表型。B） 比较野生型丙型肝炎病毒（HCV）与Pol-病毒的相对基因组复制水平。C） HCV蛋白表达的Western blot分析。检测到HCV蛋白NS3，β-actin作为...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	费舍尔科技公司	10-017-CV
非必需氨基酸	费舍尔科技公司	MT25025CI
HEPES	生命技术公司	15630080
Glutamax	生命技术公司	35050061
Opti-MEM 低血清培养基，无酚红	生命技术公司	11058-021
Huh-7.5.1	斯克里普斯研究所		该细胞系由 Francis Chisari 博士慷慨提供给 Arumugaswami 博士，基于斯克里普斯研究所与中国台湾西达斯-西奈医学中心之间签署的《材料转让协议》（MTA）
小鼠单克隆抗双链RNA抗体 J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 488	生命技术公司	A11008
山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 594	生命技术公司	A11020
印迹级封闭剂，脱脂干奶粉	伯乐公司	170-6404XTU
Tween-20	伯乐公司	170-6531XTU
抗丙型肝炎病毒 NS3 抗体 [8 G-2]	Abcam	ab65407
抗丙型肝炎病毒 NS3 抗体 [H23]	Abcam	ab13830