海马组织切片培养

摘要

我们介绍一种制备海马组织切片的方法，该方法可轻松适用于其他脑区。将脑切片置于多孔膜上，使培养基形成液-气界面。此方法可在培养中维持海马整体结构长达两周。

摘要

海马体是边缘系统的一个组成部分，在长期记忆和空间导航中发挥着重要作用¹。海马体神经元在短暂的强烈激活后，能够改变其连接的强度。这种现象被称为长时程增强（long-term potentiation, LTP），可持续数小时至数天，已成为学习与记忆最可能的机制候选者²。此外，海马体结构清晰的解剖学特征及其神经连接性³，使其成为研究突触传递和突触可塑性的经典模型系统⁴。

随着人们对海马突触生理学的理解不断深入，以及关键分子成分的逐步明确，操控突触蛋白的需求变得愈发迫切。器官型海马体培养技术不仅便于进行基因操作和精确的药理学干预，还能维持突触的组织结构，相较于常规的离体神经元培养方法，更有利于在接近自然的状态下研究突触功能。

本文介绍一种制备和培养海马脑片的方法，该方法可轻松适用于其他脑区。此方法便于通过不同手段（如病毒感染^5,6或基因枪转染⁷）对脑片进行遗传学操作。此外，脑片可方便地回收用于生化检测⁸，或转移至显微镜下进行成像⁹或电生理实验¹⁰。

方案

1. 开始制备海马脑片前的准备。

1. 通过放置一片聚四氟乙烯片并安装新刀片来准备组织切片机。
2. 用70%乙醇擦拭组织培养（TC）操作台，并将解剖显微镜放入其中。使用紫外灯对操作台、显微镜、组织切片机及所有解剖器械进行15分钟的灭菌处理。
3. 准备六孔组织培养板。每孔加入750 μL切片培养基（SCM），并在每孔中放置细胞培养插入式培养皿。确保膜完全润湿且下方无气泡。将培养板置于35°C、通入5% CO₂的培养箱中备用。
4. 将50 mL低Na⁺人工脑脊液（ACSF，解剖液）倒入100 mL烧杯中，并将其置于冰盐混合物上。用5% CO₂ / 95% O₂混合气体对低Na⁺ ACSF进行通气，直至液体颜色改变，并形成冰浆状的固液混合物（10–20分钟）。
5. 取一只P5–P7日龄的大鼠幼崽。最多可使用三只幼崽。

2. 海马切片制备。

1. 使用锋利的手术剪剪下动物头部，切开皮肤并暴露颅骨。用小剪刀沿耳间线从一侧到另一侧剪开，再沿矢状缝剪开颅骨。可选择在前部横向剪一刀，以方便去除颅骨并暴露脑组织。迅速用圆头小勺形解剖铲舀出脑组织，放入解剖液冰浆中冷却约 1 分钟。将约 10 mL 冰冷的解剖液倒入 60 mm 培养皿中，并将脑组织从烧杯转移至该培养皿中，确保脑组织....

讨论

该方法基于Stoppini et al. 首次描述的方法¹¹，提供了一种快速培养海马脑片的方式。本方案最关键的环节是保持脑片无菌；因此，必须采用适当的无菌技术，并对所有与组织接触的材料进行正确消毒和灭菌。

不同的血清来源可能影响切片的质量。我们建议先测试多个批次。如果污染问题反复出现，请检查培养箱和组织培养罩是否存在可能的污染源。在整个操作过程中正确使用无菌技术至关重要。

从断头到将脑片放置于膜上并放入培养箱的总时间不应超过1.5小时。如果操作耗时过长，将会影响脑片的存活状态。

将脑片置于多孔膜上，可通过毛细作用形成的薄层 SCM 实现充分的氧气供应和营养供给。该方法可适用于其他脑区，前提是组织密度允许氧气和营养物质充分渗透。因此，组织密度限制了该方法仅适用于较年轻的组织。对于海马组织，来自出生后6至7天（p6-p7）动物的300-400 μm厚脑片似乎可获得最佳结果。此类脑片可通过组织切片机快速制备，从而缩短组织暴露于空气中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养小室	EMD Millipore	PICM03050
6 孔板	BD Biosciences	353046
组织切片机	Stoelting Co.	51425/51415
显微镜	Olympus Corporation	SZX7-ILLD2-100
海马体解剖工具	F.S.T.	10099-15
大型通用剪刀，Perfection	F.S.T.	37500-00/37000-00 右/左手型
虹膜刮匙	F.S.T.	10093-13
直型刮匙	F.S.T.	10094-13
圆头勺状微型刮匙	VWR international	57949-039
解剖用单刃针头	Electron Microscopy Sciences	72946
解剖镊	Dumont	#2
小型解剖剪刀	F.S.T.	14060-10
MEM Eagle 培养基	Cellgro	50-019 PB
马血清（热灭活）	Invitrogen	26050-88
L-谷氨酰胺（200 mM）	Invitrogen	25030081
CaCl2（1 M）	Sigma-Aldrich	C3881
MgSO4（1 M）	Sigma-Aldrich	M2773
胰岛素（1 mg/ml），溶于 0.01 N HCl	Sigma-Aldrich	I0516
抗坏血酸溶液（25%）	Sigma-Aldrich	A4544
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523
蔗糖	Sigma-Aldrich	S5016
酚红溶液（0.5%，溶于 DPBS）	Sigma-Aldrich	P0290
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
MgCl2（1 M）	Sigma-Aldrich	M9272