我们介绍一种制备海马组织切片的方法，该方法可轻松适用于其他脑区。将脑切片置于多孔膜上，使培养基形成液-气界面。此方法可在培养中维持海马整体结构长达两周。
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本文内容
摘要
摘要
海马体是边缘系统的一个组成部分，在长期记忆和空间导航中发挥着重要作用1。海马体神经元在短暂的强烈激活后，能够改变其连接的强度。这种现象被称为长时程增强（long-term potentiation, LTP），可持续数小时至数天，已成为学习与记忆最可能的机制候选者2。此外，海马体结构清晰的解剖学特征及其神经连接性3，使其成为研究突触传递和突触可塑性的经典模型系统4。
随着人们对海马突触生理学的理解不断深入，以及关键分子成分的逐步明确，操控突触蛋白的需求变得愈发迫切。器官型海马体培养技术不仅便于进行基因操作和精确的药理学干预，还能维持突触的组织结构，相较于常规的离体神经元培养方法，更有利于在接近自然的状态下研究突触功能。
本文介绍一种制备和培养海马脑片的方法，该方法可轻松适用于其他脑区。此方法便于通过不同手段（如病毒感染5,6或基因枪转染7）对脑片进行遗传学操作。此外，脑片可方便地回收用于生化检测8，或转移至显微镜下进行成像9或电生理实验10。
方案
1. 开始制备海马脑片前的准备。
- 通过放置一片聚四氟乙烯片并安装新刀片来准备组织切片机。
- 用70%乙醇擦拭组织培养（TC）操作台，并将解剖显微镜放入其中。使用紫外灯对操作台、显微镜、组织切片机及所有解剖器械进行15分钟的灭菌处理。
- 准备六孔组织培养板。每孔加入750 μL切片培养基（SCM），并在每孔中放置细胞培养插入式培养皿。确保膜完全润湿且下方无气泡。将培养板置于35°C、通入5% CO2的培养箱中备用。
- 将50 mL低Na+人工脑脊液（ACSF，解剖液）倒入100 mL烧杯中，并将其置于冰盐混合物上。用5% CO2 / 95% O2混合气体对低Na+ ACSF进行通气，直至液体颜色改变，并形成冰浆状的固液混合物（10–20分钟）。
- 取一只P5–P7日龄的大鼠幼崽。最多可使用三只幼崽。
2. 海马切片制备。
- 使用锋利的手术剪剪下动物头部，切开皮肤并暴露颅骨。用小剪刀沿耳间线从一侧到另一侧剪开，再沿矢状缝剪开颅骨。可选择在前部横向剪一刀，以方便去除颅骨并暴露脑组织。迅速用圆头小勺形解剖铲舀出脑组织，放入解剖液冰浆中冷却约 1 分钟。将约 10 mL 冰冷的解剖液倒入 60 mm 培养皿中，并将脑组织从烧杯转移至该培养皿中，确保脑组织完全浸没在解剖液中。
- 在解剖显微镜下：将脑组织置于 60 mm 培养皿底部，用解剖镊在中线位置固定脑组织。使用海马体解剖工具分离大脑半球，保留中脑部分，使两侧半球的海马体暴露出来。然后用海马体解剖工具轻柔地将海马体舀出，再用解剖针彻底分离海马体，并尽可能清除周围组织。
- 使用截去尖端的 P1000 滤芯吸头，轻柔吸取海马体，并将其转移至切片机上的聚四氟乙烯（Teflon）片上，使海马体凹面朝下放置。
- 将海马体垂直于刀片方向排列，以获得冠状切片，并去除多余液体。
- 以每 400 μm 的间隔对海马体进行切片。
- 向 60 mm 培养皿中倒入约 10 mL 冷的 SCM 培养基，使用另一截去尖端的 P1000 滤芯吸头和冷 SCM 将切好的海马体切片从切片机转移至培养皿中，注意避免产生气泡。
- 借助虹膜铲和直铲，轻柔地将各切片彼此分离。
- 将形态完整、无损伤的切片与受损切片分开。
3. 海马切片培养
- 从培养箱中取出含有 SCM 和细胞培养插件的六孔板。借助另一支剪过的 P1000 滤芯吸头，将单个脑片转移至膜上，每张膜放置 4–5 片。注意避免将脑片置于靠近插件壁或彼此过于接近的位置。必要时，使用虹膜铲分离脑片。去除多余培养基。脑片一旦置于膜上，应尽量减少接触。
- 将培养板放回培养箱，在 35°C 和 5% CO2 条件下继续培养。
- 在超净台内每 48 小时更换一次 SCM，用巴斯德吸管吸除原有培养基，每孔加入 750 μL 新鲜预热的 SCM。注意确保膜下不产生气泡。
4. 溶液
- 低钠+ ACSF - 用于脑片培养的解剖溶液
去离子无菌 H2O添加：
500 mL 对于 1000 mL 终浓度 CaCl2 (1 M) 0.5 mL 1 mL 1 mM D-葡萄糖 0.901 g 1.802 g 10 mM KCl 0.149 g 0.298 g 4 mM MgCl₂2 (1 M) 2.5 mL 5 mL 5 mM NaHCO₃3 1.092 g 2.184 g 26 mM 蔗糖 40 g 80 g 234 mM 0.5% 酚红溶液（溶于 DPBS） 0.5 mL 1 mL 0.1% v/v
混合约30分钟
通过0.22 μm滤膜过滤灭菌
分装成50 mL等份，于4 °C保存，时间不超过2个月。 - 切片培养基（SCM）
500 mL 对于 1000 mL 终浓度 MEM Eagle 培养基 4.2 g 8.4 g 8.4 g/l 马血清，热灭活 100 mL 200 mL 20% L-谷氨酰胺（200 mM） 2.5 mL 5 mL 1 mM CaCl2 (1 M) 0.5 mL 1 mL 1 mM MgSO₄4 (1 M) 1 mL 2 mL 2 mM 胰岛素（1 mg/mL），溶于0.01 N HCl中 0.5 mL 1 mL 1 mg/L 抗坏血酸溶液（25% w/v） 0.024 mL 0.048 mL 0.00125% D-葡萄糖 1.16g 2.32g 13 mM NaHCO₃3 0.22g 0.44g 5.2 mM Hepes 3.58克 7.16克 30 mM
混合至完全溶解，并恢复至室温。
用 1 N NaOH 将 pH 值调节至 7.27–7.28
测量渗透压。用去离子并灭菌的 H 调整至 320 mmol/kg2O. 预计加入约25–40 mL。再次检测渗透压。
***调节渗透压时pH值可能会发生轻微变化，这是正常的，更重要的是确保渗透压处于正确范围（317–323）。
通过0.22 μm滤器过滤除菌。
分装成20 mL等份，在4°C下保存，可存放两到三周。
谷氨酰胺储备液：配制成200 mM浓度，分装为2.5 mL每份，-20 °C保存。
抗坏血酸储备液：配制成25%（w/v）浓度，分装为每份100 μL，于-20 °C保存。
5. 代表性结果：
在解剖镜下观察，切片应呈白色，无黑色斑点，CA1、CA3和齿状回区域轮廓清晰且无损伤。细菌污染容易通过培养基中移动的黑色小颗粒或SCM出现浑浊来识别。置于显微镜下观察时，切片在培养4天后表面应干净，细胞体清晰可辨。若培养4天后仍无法看到清晰的细胞体，且表面覆盖大量碎片，则表明切片状态不健康。
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讨论
该方法基于Stoppini et al. 首次描述的方法11，提供了一种快速培养海马脑片的方式。本方案最关键的环节是保持脑片无菌；因此，必须采用适当的无菌技术，并对所有与组织接触的材料进行正确消毒和灭菌。
不同的血清来源可能影响切片的质量。我们建议先测试多个批次。如果污染问题反复出现，请检查培养箱和组织培养罩是否存在可能的污染源。在整个操作过程中正确使用无菌技术至关重要。
从断头到将脑片放置于膜上并放入培养箱的总时间不应超过1.5小时。如果操作耗时过长，将会影响脑片的存活状态。
将脑片置于多孔膜上，可通过毛细作用形成的薄层 SCM 实现充分的氧气供应和营养供给。该方法可适用于其他脑区，前提是组织密度允许氧气和营养物质充分渗透。因此，组织密度限制了该方法仅适用于较年轻的组织。对于海马组织，来自出生后6至7天（p6-p7）动物的300-400 μm厚脑片似乎可获得最佳结果。此类脑片可通过组织切片机快速制备，从而缩短组织暴露于空气中...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国立神经疾病与卒中研究所（NINDS）- 美国国立卫生研究院（NIH）R01NS060756 项目资助
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养小室 | EMD Millipore | PICM03050 | |
| 6 孔板 | BD Biosciences | 353046 | |
| 组织切片机 | Stoelting Co. | 51425/51415 | |
| 显微镜 | Olympus Corporation | SZX7-ILLD2-100 | |
| 海马体解剖工具 | F.S.T. | 10099-15 | |
| 大型通用剪刀，Perfection | F.S.T. | 37500-00/37000-00 右/左手型 | |
| 虹膜刮匙 | F.S.T. | 10093-13 | |
| 直型刮匙 | F.S.T. | 10094-13 | |
| 圆头勺状微型刮匙 | VWR international | 57949-039 | |
| 解剖用单刃针头 | Electron Microscopy Sciences | 72946 | |
| 解剖镊 | Dumont | #2 | |
| 小型解剖剪刀 | F.S.T. | 14060-10 | |
| MEM Eagle 培养基 | Cellgro | 50-019 PB | |
| 马血清（热灭活） | Invitrogen | 26050-88 | |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Invitrogen | 25030081 | |
| CaCl2（1 M） | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4（1 M） | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| 胰岛素（1 mg/ml），溶于 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| 抗坏血酸溶液（25%） | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| 酚红溶液（0.5%，溶于 DPBS） | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgCl2（1 M） | Sigma-Aldrich | M9272 |
参考文献
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
- Shepherd, G. M. The synaptic organization of the brain. , 5th edn, University Press. Oxford. (2004).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
- Mainen, Z. F. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18, 231-239 (1999).
- Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
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重印与许可
