来源：Dembowski, J. A., Deluca, N. A. 纯化病毒DNA以鉴定相关的病毒和细胞蛋白。J. Vis. Exp. (2017)
本视频展示了使用HSV-1（单纯疱疹病毒-1）感染处于静止期的哺乳动物细胞，并利用宿主和病毒复制机制进行病毒基因组复制的过程。通过将合成核苷类似物掺入新合成的病毒DNA中，以标记正在复制的基因组，随后分离这些基因组，用于相关宿主和病毒蛋白的蛋白质组学分析。
方法文章
使用核苷类似物标记复制中的HSV-1基因组
55 次观看
⸱
2026年8月31日
本文内容
摘要
方案
1. 细胞培养、病毒感染及 EdC（5-乙炔基-2′-脱氧胞苷）标记（图1）
以下实验方案涉及病毒操作。请参考您所在机构关于病毒及其他生物制剂安全操作的生物安全规程。本方案已获得匹兹堡大学机构审查委员会的批准。
- 将一株汇合的150 cm²组织培养瓶中的MRC-5（Medical Research Council cell strain 5）细胞用胰蛋白酶消化，并将细胞转移至含有100 mL DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）加10% FBS的600 cm²组织培养板中。在37 °C、5% CO₂条件下培养3–4天，直至细胞达到汇合状态和静止期。一个汇合的600 cm²培养皿约含有7 × 10⁷个细胞。每种实验条件及相应的阴性对照各准备一块培养板。2 MRC-5（Medical Research Council细胞株5）细胞的组织培养瓶，并将细胞转移至含有100 mL DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）加10% FBS的600 cm²组织培养板中。于37 °C、5% CO₂条件下培养。 37 °C 在5% CO₂存在下2 培养3至4天以达到汇合和静止期。一个汇合的600 cm²培养皿含有约7 × 10⁷个细胞。7 细胞。每种实验条件和相应的阴性对照各准备一块培养板。
注意： 细胞必须达到静止期，以抑制细胞DNA复制，确保后续步骤中仅对vDNA（病毒DNA）进行标记和纯化。
注意： 每个样本都需要一个相应的未标记阴性对照，该对照需在相同的感染条件和时间点下制备，但不添加EdC。
注意： 应同时进行该实验的缩小规模版本，通过成像检测细胞DNA的标记情况，使用可比的细胞生长、感染、EdC标记条件和时间点（参见步骤2）。 - 将7 x 108 PFU（蚀斑形成单位）HSV-1 溶于 7 mL 冷的 Tris 缓冲盐水（TBS）中。移除培养基并置于 37 °C 保存 37 °C感染时，将7 mL稀释后的病毒加入MRC-5细胞中，室温下轻轻摇动1小时。吸附完成后，移除接种液，用50 mL室温TBS洗涤一次，然后更换为原始培养基。于37 °C、5% CO₂条件下培养。 37 °C 在5% CO₂存在下2此步骤应针对每种实验条件和相应的阴性对照分别进行。
注意： 使用在病毒dUTPase（UL50基因）和/或尿嘧啶糖基化酶（UL2基因）表达方面存在缺陷的HSV-1突变体，可提高EdC标记效率。HSV-1 dUTPase底物特异性较低，可降低多种核苷类似物的活化。 - 使用 EdC 标记病毒基因组。根据需要选择标记进入的基因组（1.3.1）、复制中的基因组（1.3.2）或病毒复制叉（1.3.3）的操作步骤。
注意： 根据后续步骤中拟分析的对象分别为进入细胞的基因组、已复制的基因组或复制叉，仅应执行步骤1.3.1、1.3.2或1.3.3中的一个。
注意： EdU 或 f-ara EdU 可替代 EdC。应监测并尽量降低核苷类似物的毒性。- 使用预先标记的病毒株在步骤1.2中进行感染，并在感染后4小时内（hpi）进入步骤2或步骤3，以分析未复制的病毒DNA（vDNA）。图1A).
注意： 使用先前所述的方案25制备预标记的病毒储备液。病毒储备液必须通过G-25柱以去除任何残留的EdC。 - 通过向感染细胞的培养基中加入 5 - 25 µM EdC，孵育 2 - 4 小时，对正在复制的病毒 DNA 进行标记（图 1B）。加入前，先将 EdC 溶于 1 mL 培养基中。 25 µM 将 EdC 加入感染细胞的细胞培养基中，孵育 2 - 4 小时（图1B添加前，将EdC溶于1 mL培养基中。
- 为了标记病毒复制叉，在vDNA复制开始后（≥4 hpi），用5 - 25 µM EdC对正在复制的vDNA脉冲标记5 - 20分钟。标记前，将EdC溶于1 mL培养基中。标记后，用含有25 - 100 µM脱氧胞苷（deoxyC）的 chase 培养基洗涤3次，然后在含 chase 培养基的条件下继续孵育20 - 40分钟（图1C）。 25 µM EdC标记5-20分钟。随后用含有25 - 100 µM 2′-脱氧胞苷（deoxyC）的 chased培养基冲洗3次，以进行chase步骤。 100 µM 2´脱氧胞苷（deoxyC），然后在加样介质中继续孵育额外的20-40分钟（图1C).
注意： 脉冲和追踪培养基应平衡至 37 °C 和5% CO₂2 使用前
注意： 对于脉冲追踪实验，必须考虑核苷进入细胞并被磷酸化后才能掺入复制DNA所需的时间，该时间需通过实验确定。
注意： 为确定脉冲追踪实验的分辨率，需计算在所用实验条件下病毒的复制速率。该速率可通过单步生长时间过程中对病毒基因组进行定量PCR测定来确定。
- 使用预先标记的病毒株在步骤1.2中进行感染，并在感染后4小时内（hpi）进入步骤2或步骤3，以分析未复制的病毒DNA（vDNA）。图1A).
结果
图1：HSV-1 DNA标记策略。（A）为检测进入细胞的病毒状态，将处于G0期的静止MRC-5细胞用预先标记的HSV-1感染，并在感染后4小时内（hpi）检测未复制的病毒DNA。（B）为检测已复制病毒的状态，用未标记的HSV-1感染MRC-5细胞，并在病毒DNA复制启动后（≥4 hpi），向感染细胞的培养基中加入EdC（橙色星号），孵育2–4小时。（C）为检测病毒复制叉，对感染细胞进行5–20分钟的EdC脉冲标记，随后可用脱氧胞苷（deoxyC）进行追踪。EdC标记的DNA呈橙色。该图经Dembowski和DeLuca修改
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MRC-5 细胞 | ATCC | CCL-171 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 26140-179 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco | 12800-082 | 添加 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、12 mM（用于培养瓶中培养）或 30 mM（用于培养皿中培养）碳酸氢钠 |
| 600 cm² 组织培养皿 | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris 缓冲盐水（TBS），pH 7.4 | 137 mM NaCl、5 mM KCl、491 mM MgCl、680 mM CaCl、25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 病毒储备液 | 滴度高于 1×10⁹ PFU/mL 的病毒储备液效果最佳 | ||
| 5´-乙炔基-2´-脱氧胞苷（EdC） | Sigma-Aldrich | T511307 | 溶于 DMSO 配制成 40 mM 储备液，分装后于 -20 °C 保存 |
| 细胞培养孵育箱 | |||
| 生物安全柜 | |||
| 加热块 | 65 °C 和 95 °C |
