病毒DNA-蛋白质复合物中蛋白质的分离

摘要

来源：Dembowski, J. A., et al. 病毒DNA的纯化以鉴定相关病毒和细胞蛋白. J. Vis. Exp. (2017).

本视频演示了利用点击化学和磁珠纯化技术从细胞核中分离蛋白质-病毒DNA复合物的方法。该方案包括使用炔基修饰的核苷酸标记病毒基因组、通过点击反应进行生物素化，以及与链霉亲和素包被的磁珠结合。经过洗涤和热洗脱后，收集纯化的复合物，速冻并保存以用于后续分析。

方案

1. 病毒DNA及其相关蛋白的纯化

注意：所有缓冲液和试剂在使用前应置于冰上预冷，除非另有说明，所有操作步骤均应在冰上进行。

1. 收集细胞核。注意：在分离细胞核之前，可使用甲醛将蛋白质与DNA进行交联。随后在链霉亲和素包被的磁珠上进行DNA纯化时，可采用更严格的洗涤条件。
   1. 用20 mL细胞核提取缓冲液（NEB）替换培养基，在4 °C下孵育20分钟，期间偶尔轻轻摇动。在显微镜下可观察到细胞核。
   2. 使用细胞刮刀将细胞核从培养板上刮下，转移至50 mL锥形管中，在4 °C下以2,500 × g离心10分钟以收集细胞核沉淀，弃去上清液。
      注意：可使用台盼蓝染色验证细胞核是否成功从细胞中分离。
   3. 用10 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻柔重悬细胞核沉淀，转移至15 mL锥形管中，在4 °C下以2,500 × g离心10分钟收集沉淀，彻底去除PBS。
      注意：此时可将细胞核冷冻，实验流程可在此暂停。若需冷冻，将细胞核沉淀轻柔重悬于500 µL冻存缓冲液中，将管子置于乙醇/干冰浴中速冻，随后于-80 °C保存。使用前在室温下解冻细胞核，迅速转移至冰上，加入10 mL PBS，轻柔摇动混匀，在4 °C下以2,500 × g离心10分钟收集沉淀，并彻底去除PBS。冷冻可能导致得率降低。
2. 将生物素叠氮化物共价连接至5-乙炔基-2′-脱氧胞苷（EdC）标记的病毒DNA或vDNA。
   1. 用10 mL点击反应混合液[见材料表]轻柔吹吸5次，重悬细胞核沉淀。
      注意：点击反应混合液中的试剂必须按指定顺序添加。
   2. 在4 °C下旋转孵育1小时。旋转期间，准备并预冷缓冲液B1、B2和B3[见材料表]。
   3. 在4 °C下以2,500 × g离心10分钟收集细胞核沉淀，彻底去除点击反应混合液，用10 mL PBS轻柔重悬沉淀并再次在4 °C下以2,500 × g离心10分钟进行洗涤。
   4. 用大孔枪头将细胞核沉淀轻柔重悬于1 mL PBS中，转移至1.5 mL微量离心管中，在4 °C下以2,500 × g离心10分钟收集沉淀，彻底去除PBS后在液氮中速冻。
      注意：实验流程可在此暂停，冷冻的细胞核可在-80 °C下长期保存。冻融有助于后续裂解，因此即使当天继续进行步骤1.3，也建议进行速冻。
3. 裂解细胞核并片段化DNA。
   1. 将细胞核在冰上解冻，用移液器上下吹打使其重悬于500 µL缓冲液B1中，在冰上孵育45分钟。
   2. 使用3 mm微探头，在40%振幅下对样品进行6次超声处理，每次30秒，脉冲间将样品置于冰上冷却30秒。超声处理后，样品应变得澄清，不再浑浊。
      注意：超声条件应根据具体超声仪进行优化。
   3. 在4 °C下以14,000 × g离心10分钟，沉淀细胞碎片，沉淀体积应显著减小。将上清液通过100 µM细胞滤网过滤，收集滤过液。
   4. 向过滤后的上清液中加入500 µL缓冲液B2。该样品中的900 µL将用于步骤1.4.2。
   5. 取各条件下的等分样品（50 µL或总体积的1/20）用于DNA分离，加入50 µL 2×十二烷基硫酸钠（SDS）-碳酸氢盐溶液[见材料表]，随后进行DNA分离实验流程。
   6. 取各条件下的等分样品（50 µL或总体积的1/20）作为输入蛋白样品，加入50 µL 2×Laemmli上样缓冲液，在液氮中冷冻后于-80 °C保存。
4. 将生物素标记的DNA结合至链霉亲和素包被的磁珠。
   1. 将300 µL磁珠悬液转移至1.5 mL微量离心管中，为每个样品准备一管磁珠。用1 mL缓冲液B2洗涤磁珠3次：涡旋重悬，使用磁力架分离磁珠，吸除洗涤液。
      注意：优化的结合条件可实现最大得率并最小化背景结合。实验确定，Streptavidin T1磁珠相比琼脂糖珠及其他链霉亲和素磁珠具有显著更高的结合容量，且相比Streptavidin C1磁珠背景结合更低（图1A）。
   2. 向洗涤后的磁珠中加入步骤1.3.4所得的900 µL样品，在4 °C下旋转孵育过夜。
      注意：样品加入磁珠后切勿涡旋。
      注意：若未标记的阴性对照中检测到大量DNA或蛋白，可将孵育时间由过夜缩短至4小时，以降低背景结合。
5. 洗涤磁珠并洗脱vDNA及其结合蛋白。
   注意：建议后续步骤使用滤芯枪头。
   1. 将样品置于磁力架中，去除上清液，用1 mL缓冲液B2轻柔重悬，在4 °C下旋转5分钟。
   2. 重复步骤1.5.1三次。
   3. 将样品置于磁力架中，去除上清液，用1 mL缓冲液B3轻柔重悬，在4 °C下旋转5分钟。
   4. 取100 µL磁珠混合物（总体积的1/10）转移至新管，用于结合DNA的分离。将该管置于磁力架上，去除上清液，用100 µL 1×十二烷基硫酸钠（SDS）或SDS-碳酸氢盐溶液重悬磁珠，随后进行DNA分离实验流程。
   5. 将步骤1.5.3中剩余的900 µL磁珠混合物置于磁力架上，去除上清液，用50 µL 2×Laemmli上样缓冲液重悬磁珠，以洗脱蛋白及DNA-蛋白复合物。
   6. 在95 °C下煮沸样品15分钟，涡旋，短暂离心，置于磁力架上。将洗脱液转移至新管，速冻后于-80 °C保存。
      注意：使用带盖紧固的离心管，防止煮沸时管盖弹开。
      注意：实验流程可在此暂停，样品可在-80 °C下保存数周。
   7. 通过考马斯亮蓝染色、蛋白质印迹或质谱分析蛋白样品。代表性结果见图1和图2。
      注意：为评估蛋白得率是否满足质谱分析要求，每份样品取7.5 µL进行考马斯亮蓝染色分析，另取7.5 µL用于检测代表性病毒基因组相关蛋白（ICP4、ICP8或UL42）的蛋白质印迹。同时平行运行步骤1.3.6所得的相同体积裂解液，以控制输入蛋白水平。剩余样品（35 µL）用于质谱分析。

结果

图1：代表性蛋白质纯化结果。 (A) 使用多种不同类型的链霉亲和素包被磁珠进行纯化步骤时蛋白质得率的比较。在存在 EdC（+）条件下进行感染以比较蛋白质得率，或在不存在 EdC（-）条件下进行感染以比较背景结合。感染及 EdC 标记均按前述方法进行, 使用等量的不同类型链霉亲和素包被磁珠纯化DNA-蛋白质复合物。上图：比较经链霉亲和素包被琼脂糖珠或Streptavidin M-280纯化后的蛋白得率。下图：比较经Streptavidin M-270、M-280、Streptavidin C1或Streptavidin T1纯化后的蛋白得率。使用针对病毒蛋白ICP4的抗体进行Western blot检测。第一泳道显示纯化的ICP4作为对照。下图需延长曝光时间以在泳道中观察到相似强度的ICP4信号 "280" 如上图所示。B) 展示了不同 EdC 标记时间下的代表性蛋白质纯化结果。进行了病毒感染和 EdC 标记，并使用链霉亲和素 T1 磁珠纯化 DNA-蛋白质复合物。EdC 标记时间分别为 0、20、40 或 60 分钟，结果显示了考马斯亮蓝染色（上图）和蛋白质印迹（下图）的结果。蛋白质印迹使用针对 ICP4、UL42 或 GAPDH 的特异性抗体进行检测。洗脱样品取自步骤 1.5.5，裂解液样品取自步骤 1.3.6。箭头指示链霉亲和素，L 表示蛋白质分子量标记。

图2：蛋白质组学数据呈现方式的示例。 （A）饼状图总结了在感染后6小时纯化的病毒基因组相关蛋白洗脱物中通过质谱鉴定出的蛋白质。数值表示每个功能类别中鉴定出的蛋白质数量。T表示鉴定出的蛋白质总数。颜色代表以下类别：紫色—RNA加工，红色—转录，绿色—染色质重塑，橙色—DNA复制，黄色—核转运，蓝绿色—细胞骨架，深蓝色—HSV结构蛋白，灰色—其他/未知。（B）维恩图显示了在感染后6、8或12小时与病毒基因组相关联的蛋白质之间的重叠情况。（C）STRING相互作用图展示了在EdC脉冲标记5分钟后富集于病毒复制叉上的蛋白质。与未标记的阴性对照相比富集5倍以上的人类蛋白质显示在功能相互作用图中，该图使用STRING生成，并设置为仅显示高置信度相互作用。使用基因名称来映射相互作用。圆圈表示在相同生物学过程中发挥作用的蛋白质。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MRC-5 细胞	ATCC	CCL-171
胎牛血清（FBS）	Gibco	26140-179
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	12800-082	添加 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、12 mM（用于培养瓶培养）或 30 mM（用于培养皿培养）碳酸氢钠
600 cm² 组织培养皿	Thermo Fisher Scientific	166508
Tris 缓冲盐水（TBS），pH 7.4			137 mM NaCl、5 mM KCl、491 mM MgCl、680 mM CaCl、25.1 mM Tricine
HSV-1 储备液			滴度高于 1×10⁹ PFU/mL 的储备液效果最佳
Sephadex G-25 柱（PD-10 脱盐柱）	GE Healthcare	17085101
二甲基亚砜（DMSO）	Fisher Scientific	D128-1
5´-乙炔基-2´-脱氧胞苷（EdC）	Sigma-Aldrich	T511307	溶于 DMSO 配制成 40 mM 储备液，分装后于 -20 °C 保存
2´-脱氧胞苷（deoxyC）	Sigma-Aldrich	D3897	溶于水配制成 40 mM 储备液，分装后于 -20 °C 保存
核提取缓冲液（NEB）			现配现用（20 mM Hepes pH 7.2、50 mM NaCl、3 mM MgCl₂、300 mM 蔗糖、0.5% Igepal）
细胞刮刀	Bellco glass	7731-22000	使用前高压灭菌
台盼蓝溶液	Sigma-Aldrich	T8154
PBS，pH 7.2（10x）			1.37 M NaCl、27 mM KCl、100 mM Na₂HPO₄、18 mM KH₂PO₄（使用前用无菌水稀释至 1x）
五水合硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）	Fisher Scientific	C489	配制 100 mM 储备液，4 °C 保存不超过 1 个月
(+) L-抗坏血酸钠	Sigma-Aldrich	A4034	新鲜配制 100 mM 储备液，冰上保存至使用
生物素叠氮化物	Invitrogen	B10184	用 DMSO 配制 10 mM 储备液，分装后于 -20 °C 保存，最长可保存 1 年
点击反应混合液			使用前立即按指定顺序加入试剂配制（10 mL：8.8 mL 1x PBS、200 μL 100 mM CuSO₄、25 μL 10 mM 生物素叠氮化物、1 mL 100 mM 抗坏血酸钠）
完全蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11697498001	溶于 1 mL 水中配制成 50x 储备液，4 °C 可保存 1 周，或直接将 1 片加入 50 mL 缓冲液中
冻存缓冲液			现配现用（7 mL 100% 甘油、3 mL NEB、200 μL 50x 蛋白酶抑制剂）
缓冲液 B1			现配现用（25 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8、1% Igepal、1x 蛋白酶抑制剂）
缓冲液 B2			现配现用（150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8、0.5% Igepal、1x 蛋白酶抑制剂）
缓冲液 B3			现配现用（150 mM NaCl、2 mM EDTA、50 mM Tris-HCl pH 8、1x 蛋白酶抑制剂）
配备 3 mm 微型探头的 Vibra Cell 超声波处理器	Sonics	VCX 130
细胞筛	Falcon	352360
Dynabeads MyOne 链霉亲和素 T1	Life Technologies	65601
DynaMag-2 磁力架	Life Technologies	12321D
微型管旋转仪	Fisher Scientific	260750F
2x Laemmli 上样缓冲液			将 400 mg SDS、2 mL 100% 甘油、1.25 mL 1 M Tris（pH 6.8）和 10 mg 溴酚蓝溶于 8 mL 水中。4 °C 保存不超过 6 个月。使用前加入 1 M DTT 至终浓度 200 mM。
1.5 mL 管帽锁	Fisher Scientific	NC9679153
常规 Western 印迹试剂
NOVEX 胶体蓝染色试剂盒	Invitrogen	LC6025
12 孔组织培养皿	Corning	3513
盖玻片	Fisher Scientific	12-545-100	使用前高压灭菌
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-552-5
16% 戊二醛	Electron Microscopy Sciences	15710	使用前用 1x PBS 稀释至 3.7%
牛血清白蛋白（BSA）	Fisher Scientific	BP1605	用 1x PBS 配制成 3% 溶液
通透缓冲液（0.5% Triton-X 100）	Sigma-Aldrich	T8787	用 1x PBS 配制成 0.5% Triton-X 100 溶液
点击反应混合液 — Click-iT EdU Alexa Fluor 488 成像试剂盒	Molecular Probes	C10337	按照制造商说明书配制
2x SDS-碳酸氢盐溶液			2% SDS、200 mM NaHCO₃
10x Tris EDTA（TE），pH 8.0			100 mM Tris、10 mM EDTA（使用前稀释至 1x）
适用于 1.5 mL 管的微量离心机
适用于 15 和 50 mL 管的台式离心机
细胞培养箱
生物安全柜
加热块			65 °C 和 95 °C