大规模生产高容量腺病毒载体

摘要

来源：Ehrke-Schulz, E., 等. 基于人5型腺病毒的高容量腺病毒载体的克隆与大规模生产。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了在表达Cre重组酶的悬浮适应型人胚胎肾细胞中大规模扩增高容量腺病毒载体的方法，可用于需要高滴度、无辅助病毒载体的基因递送应用。

方案

1. 在悬浮培养的116细胞中大规模扩增高容量腺病毒载体（HCAdV）

1. 向一个3-L的旋转培养瓶中加入900 ml预热（37 °C）的新鲜MEM（最低必需培养基），培养基中添加10%胎牛血清（FBS）和潮霉素B（100 µg/ml）（图1B）。
2. 从至少10个单独的150-mm组织培养皿中移除培养基，这些培养皿中的116细胞已生长至90–100%汇合度，使用移液管加入10 ml预热（37 °C）的新鲜MEM（含10% FBS和100 µg/ml潮霉素B）冲洗细胞。反复吹打数次以获得均匀的细胞悬液。立即将细胞直接转移至步骤1.1中已装有900 ml培养基的旋转培养瓶中。
   注意：请勿使用胰蛋白酶/EDTA（乙二胺四乙酸），因其可能对悬浮细胞的生长产生不利影响。移除培养基后应立即转移细胞至旋转培养瓶。每次操作不要超过两个组织培养皿。加入新鲜培养基后等待时间越长，细胞从培养皿表面脱离就越困难。
3. 为确保细胞最佳生长，将旋转培养瓶置于磁力搅拌器上，在组织培养孵育箱中于37 °C和5% CO₂条件下培养24小时。将磁力搅拌器转速调节至70 rpm，以防止细胞贴附于玻璃表面。
4. 监测旋转培养瓶中的细胞生长情况，以评估细胞是否具有活性以及是否生长至足够数量。每次添加新鲜培养基前，从生物反应器中取出2 ml转移至60-mm组织培养皿中，在显微镜下观察细胞形态。
   注意：悬浮于培养基中呈团块状生长的细胞表明细胞生长状态和活性良好（另见图2C）。24小时后，细胞将在组织培养皿表面形成集落，30–50%的汇合度表示细胞密度适宜。
5. 建立旋转培养瓶24小时后，加入500 ml新鲜培养基（MEM，含10% FBS）并补充潮霉素B（100 µg/ml）。24小时后重复此步骤。
6. 建立旋转培养72小时后，加入1,000 ml含潮霉素B（100 µg/ml）的新鲜MEM培养基（含10% FBS），使细胞悬液总体积达到3 L。
7. 当体积达到3升后24小时，于室温（RT）下以500 × g离心10分钟收集116悬浮细胞。弃去上清液。将空的旋转培养瓶保留在组织培养超净台内。
8. 用含5% FBS的新鲜MEM重悬细胞沉淀，上下吹打约8–10次，以获得均匀的细胞悬液。该悬液用于后续细胞感染，总体积为150 ml。
   1. 方案a：使用P3代裂解物感染116悬浮细胞，将细胞转移至装有无菌磁力搅拌子的250-ml储存瓶或250-ml小规模旋转培养瓶中，并利用P3代裂解物中的病毒与每细胞2个转导单位（TU）的辅助病毒（HV）共同感染细胞。假设细胞密度为每毫升3 × 10⁵个，则总细胞数为9 × 10⁸个。因此，需加入1.8 × 10⁹ TU的HV。
   2. 方案b：使用纯化的病毒原液感染116悬浮细胞，将步骤1.8所得细胞转移至装有无菌磁力搅拌子的250-ml储存瓶或250-ml小规模旋转培养瓶中，并以每细胞100个病毒颗粒（VP）的剂量加入先前纯化的HCAdV进行共感染。因此，根据纯化HCAdV的物理滴度，加入9 × 10¹⁰ VP的HCAdV以及1.8 × 10⁹ TU的HV。
9. 将步骤1.8.1或1.8.2所得的细胞-病毒混合物置于磁力搅拌器上，在组织培养孵育箱中于37 °C和5% CO₂条件下以60 rpm搅拌2小时。确保储存瓶未完全密封，以允许空气流通。
10. 感染后2小时，将细胞-病毒混合物的全部体积转移回3-L旋转培养瓶中，并加入1,850 ml预热（37 °C）的新鲜MEM培养基（含5% FBS），使总体积达到2 L，在组织培养孵育箱中于37 °C和5% CO₂条件下以70 rpm继续培养48小时。
11. 在500-ml离心管中于室温下以890 × g离心10分钟收集细胞。弃去培养基，将细胞沉淀重悬于28 ml的DPBS（Dulbecco磷酸盐缓冲液）中。上下吹打以获得均匀的细胞悬液。将细胞-病毒悬液在液氮或-80 °C条件下冷冻，确保完全冻结。将细胞-病毒悬液于-80 °C保存，直至开始病毒纯化步骤。

结果

图1. 高容量腺病毒载体扩增与纯化的示意图。（A）高容量腺病毒（HCAdV）DNA转染与辅助病毒（HV）感染：将携带目的基因（GOI）的线性化HCAdV基因组转染至HCAdV生产细胞系（116细胞），随后用辅助病毒AdNG163R-2感染。（B） HCAdV的扩增：通过连续将细胞裂解物转移至新的组织培养皿并同时与辅助病毒共感染进行预扩增后，大规模生产在3 L悬浮培养体系中进行。（C）

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
潮霉素B	PAN Biotech	P02-015	筛选表达CRE的116细胞
DMEM	PAN Biotech	P04-03590	HEK293T细胞培养基
最低必需培养基（MEM）Eagle	PAN Biotech	P04-08500	116细胞培养基
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	PAN Biotech	P04-36500	细胞洗涤、细胞重悬
250 ml储存瓶	Sigma	CLS430281-24EA	悬浮培养的116细胞感染
500 ml聚丙烯离心管	Sigma	CLS431123-36EA	从悬浮培养物中沉淀细胞
旋转培养瓶	Bellco	1965-61030	悬浮培养116细胞