一种用于模拟导管相关性尿路感染的3D打印硅胶涂层装置

摘要

来源：
Ocean E. Clarke¹, Romy A. Dop¹, Tom Hasell¹, Joanne L. Fothergill¹, Daniel R. Neill<sup>2

1</sup>利物浦大学, ²邓迪大学

本视频演示了一种3D打印、硅胶涂层装置的使用方法，该装置可模拟导尿管的内表面，用于模拟导管相关性尿路感染。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. Flexipeg 模型的增材制造

1. 使用立体光刻技术（层高100 µm）以耐高温树脂打印钉柱（每个钉盖需24个钉柱）和钉盖。
   注意：钉柱使用耐高温树脂，钉盖可在实验前进行高压灭菌。
2. 使用熔融沉积成型（FDM）技术，以60%填充率打印模具的两个组件以及试管架的部件。
   注意：任何耐用树脂均适用于FDM，因为模具和试管架可用乙醇灭菌，无需具备高温稳定性。
3. 确保模型组件已正确打印，并使用70%乙醇清除打印过程中残留的多余物质。
4. 按图1所示组装硅胶垫模具，必要时用胶带固定两侧。

2. Flexipeg 模型制备

1. 硅胶垫制备
   1. 称取18 g硅胶基料（基料与催化剂聚二甲基硅氧烷（PDMS）比例为10:1，缩合固化型）至烧杯中，轻轻混入2 g催化剂，直至充分混合。
      注意：避免过度搅拌硅胶混合物，以防在模具内产生气泡。
   2. 将混合好的硅胶倒入FDM打印的模具中，擦去模具侧面和顶部多余的硅胶。在室温（RT）下静置过夜固化（至少18小时）。
   3. 将垫片从模具中取出，并修剪掉边缘多余的硅胶。确保垫片能适配于插针盖内，如图1所示。
2. 插针涂覆
   1. 将插针插入硅胶垫中（每垫24根插针），并用胶带将垫片固定在插针盖或与垫片尺寸相近的塑料托盘上。
   2. 称取27 g硅胶基料至一个浅口塑料托盘中（尺寸约与96孔板相同），彻底混入3 g催化剂，直至充分混合。
   3. 将插针盖倒置，使插针朝下，立即将插针浸入硅胶混合物中。然后翻转插针盖，使多余硅胶沿插针流下，并在室温下静置过夜固化。
      注意：快速固化硅胶（完全固化需6–8小时；操作时间40–60分钟）在固化前会持续滴落或流动；因此，在浸涂时无需确保插针整个表面都被PDMS覆盖，因为在固化过程中多余的硅胶会自然流至插针其他部位。
   4. 固化完成后，重复步骤2.2.2至2.2.3，直至插针完成三次PDMS涂覆。确保第一层涂层完全固化后，再进行第二层涂覆。
      注意：最终插针涂层厚度应<2 mm，且无可见缺陷。若在室温孵育过夜后硅胶仍发黏，可继续固化24小时；若插针触感仍发黏，则应弃用该涂层。
   5. 使用无菌手术刀，在硅胶包覆的插针基部周围进行切割（尽可能贴近底部），以将插针从涂覆装置上取下。
      注意：应重复此过程，直至制备出所需数量的插针和硅胶垫。插针涂覆过程中多余的未固化PDMS可在固化前用于浇铸新的硅胶垫。
3. 模型组装
   1. 将已涂覆的插针插入硅胶垫中，并将垫片固定在插针盖内，如图1所示。
   2. 用可高压灭菌胶带封住插针盖/硅胶垫（连接插针底座的一侧）的底面，以固定插针位置。将插针盖组件放入密封的可高压灭菌袋中，在使用前进行高压灭菌处理。
      注意：插针盖中的插针只能以单一方向插入96孔板。在用胶带固定插针组件后，应将其放入备用的96孔板中检查对齐情况，并在胶带上标注正确的盖子方向。

3. 模型接种

1. 细菌培养物的制备
   1. 取固体培养基上生长的待测细菌菌落，用接种环挑取一环接种于10 mL LB（Luria-Bertani）液体培养基中，37 °C 振荡培养过夜（18 h），制备过夜培养物。
      注意：建议在Flexipeg生物膜模型中至少使用三个生物学重复。
   2. 将培养物用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至终体积1 mL，调整其OD_600nm为0.1（经平板稀释后，约为10⁸菌落形成单位（CFU）/mL）。
2. 微量滴定板设置与接种
   1. 根据图1（8）所示的板布局，向96孔板中每个待测孔加入135 µL混合人尿液（PHU）。每个孔代表一个技术重复（每个生物学重复至少需要n = 3个技术重复）。
      注意：如实验者需要，可使用人工尿液培养基（AUM）替代PHU。
   2. 向每个待测孔中加入15 µL已标准化的过夜培养物，使每孔终体积为150 µL。保留至少100 µL标准化过夜培养物用于后续系列稀释，以验证接种物的CFU/mL。
   3. 通过仅向相应孔中加入150 µL无菌PHU来设置阴性对照。
   4. 完成微量滴定板设置后，将 peg 插入其对应孔中（peg在高压灭菌前已预先确定位置），并确保peg盖与板表面齐平。必要时用高压灭菌胶带将微孔板盖固定在peg盖上。
   5. 将peg模型置于密封的塑料箱或塑料袋中，并放入湿润的蓝纸以防止蒸发，在37 °C静置培养24 h。
3. 接种物验证
   1. 在96孔微量滴定板第一列的第2至第6行各孔中加入180 µL PBS，并将保留的100 µL标准化过夜培养物加入第一孔中。
   2. 从第一孔中取出20 µL标准化过夜培养物，加入第二孔中，轻轻吹打混匀。
   3. 重复步骤3.3.2，直至初始接种物被稀释至最后一孔（1 × 10⁵）。
   4. 将每个稀释度的10 µL样品以三点重复方式点种于适当的固体培养基上。37 °C静置培养过夜。
   5. 培养后，计数每个点上的菌落数量，计算接种物的实际CFU/mL。

4. 生物膜定量

1. 聚乙二醇处理
   1. 孵育结束后，将 peg 模型从微孔板中取出，在火焰下或微生物安全柜中倒置（peg 朝上），弃去微孔板。
   2. 将带栓盖板转移至含有180 µL无菌PBS的全新微孔板中，以去除未贴壁的细胞。在新鲜PBS中重复此步骤两次，共完成三次洗涤步骤。
      注意： 为防止对表面相关生物膜造成损伤，在将 peg 盖从各微孔板上取下时，应避免触碰 peg 或孔边缘。
2. CFU/mL 计数（生物膜相关）
   1. 在火焰旁或生物安全柜中无菌操作，按图示将步骤 1.2 中制备的试管架用无菌玻璃试管装好 图1，并安装与插销盖相匹配的架顶。
   2. 无菌操作，将 600 µL 无菌 PBS 分装至各试管中。
   3. 将插针盖放入支架中，使插针与支架中的试管对齐。移除插针盖上的高压灭菌指示胶带。
   4. 使用无菌镊子将插销穿过插销盖，并插入下方对应排列的试管中。
   5. 更换管盖，涡旋振荡每管60秒，使生物膜相关细胞从 peg 表面分散。
   6. 从每根试管中取出 100 µL，按照之前步骤 3.3 的方法在无菌 PBS 中进行系列稀释。
   7. 使用血清学移液管将每种稀释液各取10 µL点样于适当的固体培养基上，于37 °C静置培养过夜。
   8. 孵育结束后，计数每个稀释平板上的菌落数量，并据此计算CFU/mL。
3. 结晶紫染色
   1. 将0.1%（w/v）结晶紫（溶于无菌水）各180 µL分装至96孔微孔板中的24个待测孔中。
   2. 将清洗后的 peg 模型（包括 pegs 和 peg 盖）插入微孔板的相应孔中。室温静置孵育 20 分钟。
   3. 孵育结束后，从微孔板中取出 peg 模型，并丢弃微孔板。
   4. 在合适大小的容器中，用自来水轻轻搅动冲洗整个插销装置，重复三次。
   5. 倒置 peg 模型，使其在室温下完全干燥。
   6. 将180 µL 30%乙酸移取至新的96孔微孔板中，将干燥的钉模型插入相应孔内。室温孵育30分钟。
   7. 从微孔板上取下 peg 模型并读取 OD 值_{540 nm} 使用微孔板读数仪或分光光度计检测染色后的孔。
   8. 为计算柱上的生物膜形成量，取OD值的平均值_{540 nm} 将染色的阴性对照钉的平均值从测试组钉的平均值中减去。

结果

图1：Flexipeg 模型装置的示意图。（1）单个 Flexipeg，表面涂覆聚二甲基硅氧烷（PDMS），以模拟导尿管表面用于生物膜形成。（2）Flexipeg 生物膜装置，包含（3）用于固定单个 peg 的硅胶垫和（4）可适配 96 孔板的盖子。各组件通过增材制造技术制备。

使用耐高温树脂进行的立体光刻（1...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔微孔板	Greiner	650161	U型/圆底。
乙酸	SLS	695092-2.5LSIG	≥ 99.7% ACS级试剂。
结晶紫	Merck	61135-25G
单个插针	自制	Flexipeg组件需3D打印	使用耐高温树脂进行增材制造（每个Flexipeg模型需要24个插针）。由Protolabs（NL）使用Formlabs高温树脂制造。
LB（Luria-Bertani）肉汤	Neogen	NCM0088B	LB肉汤（Miller）。
适用于96孔板的盖子	自制	Flexipeg组件需3D打印	使用耐高温树脂进行增材制造。
用于制备硅胶垫的模具	自制	Flexipeg组件需3D打印	使用任何耐用材料进行增材制造。由Protolabs（NL）使用ABS原型树脂制造。
用于制备硅胶垫侧面的模具	自制	Flexipeg组件需3D打印	使用任何耐用材料进行增材制造。
磷酸盐缓冲液（PBS）	Merck	P4417-50TAB
混合人尿液	-	-	在获得大学中央研究伦理委员会伦理批准后，从健康供体收集。
玻璃管架	自制	Flexipeg组件需3D打印	使用任何耐用材料进行增材制造。
硅橡胶（PDMS）	MB Fibreglass	GP3481-F	Polycraft通用型室温硫化（RTV）缩合固化模具用硅橡胶。
适用于插针盖的顶盖	自制	Flexipeg组件需3D打印	使用耐高温树脂进行增材制造。
弗利导尿管	Great Bear Healthcare UK Ltd		14 法规号，100% 硅胶