来源：Ehrke-Schulz, E., 等. 基于人5型腺病毒的高容量腺病毒载体的克隆与大规模生产。J. Vis. Exp. (2016)
本视频展示了利用氯化铯梯度超速离心法纯化高容量腺病毒载体，从而实现含有基因组的病毒颗粒的分离，可用于基因递送、载体表征以及临床前治疗研究。
方法文章
基于氯化铯梯度超速离心法纯化携带基因组的腺病毒载体
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2026年8月31日
本文内容
摘要
方案
- 高容量腺病毒载体（HCAdV）的纯化与透析
- 为制备用于氯化铯（CsCl）梯度离心的病毒裂解液，将细胞-病毒悬液在液氮中冷冻，随后在水浴中解冻 37 °C 4x.
- 在室温下以 500 × g 离心病毒裂解液 8 分钟，并收集含有 HCAdV（高容量腺病毒载体）的上清液。
- 用于超速离心时，按如下方法配制 CsCl 溶液。称取 37.5 g（对应 1.5 g/cm³）CsCl，溶于适量 PBS 中，定容至 50 mL，充分溶解，得到密度为 1.5 g/cm³ 的 CsCl 溶液。3），33.5 g（适用于1.35 g/cm3），以及 31.25 g（适用于 1.25 g/cm3) 的 CsCl 粉末，并用 dH₂O 定容至20 至 25 ml。
- 搅拌至溶液澄清，然后对溶液进行无菌过滤。最后，分别取出1 ml每种溶液，用精密天平称重，以检查密度是否正确。1 ml溶液的重量应分别为1.5 g、1.35 g和1.25 g。
- 如果密度过高，可通过逐步加入小体积（µl无菌 dH₂O 的）2O. 加入 dH₂O 后2O再次测量密度。如有必要，加入更多dH₂O2O.
- 重复该步骤，直至密度正确。若密度偏低，可加入少量 CsCl 粉末进行调节。再次经无菌滤器过滤后检测密度。若密度过高，则通过加入 dH₂O 进行调节。2如前所述。如果密度仍然过低，则加入更多氯化铯，再次进行无菌过滤，并检测密度。重复该步骤直至密度达到要求。
- 在6个透明超速离心管中制备CsCl阶梯梯度。使用以下顺序，小心且缓慢地移液加入CsCl溶液：1.5 g/cm³的CsCl溶液0.5 ml，3 CsCl 溶液，1.35 g/cm³，3 ml3 CsCl 溶液和 3.5 ml 的 1.25 g/cm3 CsCl 溶液（图1C).
- 将步骤 1.2 中获得的约 4.5 ml 澄清的载体上清液覆盖于 1.25 g/cm³ 蔗糖缓冲液上方3 CsCl 层。使用甩摆转子（SW-41）在超速离心机中对梯度进行离心 12 °C 在226,000 × g（35,000 rpm）条件下，以缓慢加速和减速模式超速离心至少2小时，以分离含有HCAdV基因组的病毒颗粒与空颗粒及细胞碎片。
注意： 在最佳条件下，试管顶部会形成一层弥散的细胞碎片带。其下方可见两条白色条带，上层条带含有空壳颗粒，而下层条带为 HCAdV图1C 和 2A). - 小心移除细胞碎片和空颗粒层，从每根离心管中收集1 ml底部条带，用洁净的移液枪头将病毒转移至一个无菌的50 ml离心管中。加入最多24 ml密度为1.35 g/cm³的氯化铯溶液³ 将 CsCl 溶液加入收集的病毒颗粒中并小心混匀。
- 用 1.35 g/cm³ 的氯化铯溶液填充离心管3 将 CsCl-病毒溶液加至顶部，在 226,000 × g（35,000 rpm）条件下离心过夜（18–20 小时），温度为 12 °C 在超速离心机中使用水平转子（SW-41），采用缓慢加速和减速模式。
- 收集位于明显下层条带中的HCAdV。由于上层条带可能含有空颗粒，需使用移液器从顶部移除上层液体（参见 图1C 和 2B然后，用移液器移除下层条带。
- 对收集的病毒颗粒进行透析以置换缓冲液。
- 剪取一段长约 8 cm 的透析袋（截留分子量：50,000），用无菌去离子水冲洗2O 次，重复 3 次。然后用塑料夹夹闭透析袋的一端，使用 1 ml 移液器将步骤 5.8 中收集的病毒转移至透析袋内。避免袋内产生气泡，并用塑料夹夹闭另一端完成透析袋的封口。
- 在透析缓冲液（10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10%甘油和1 mM MgCl₂）中透析，体积为1 L2 （氯化镁）溶于去离子 H2O）2 小时 4 °C 缓慢搅拌下进行。更换透析缓冲液为2 L透析缓冲液，过夜透析 4 °C 在缓慢搅拌下。或者，使用蔗糖缓冲液（140 mM NaCl（氯化钠），5 mM Na2高容量腺病毒载体4.2H2O（磷酸氢二钠，1.5 mM KH2PO4 （磷酸二氢钾）和 730 mM 蔗糖，pH 7.8）
- 从步骤 1.9.2 中使用 1 ml 移液器收集透析后的病毒颗粒。准备多个所需的小体积分装样品（25–100 µl) 并将纯化的病毒在 -80 °C.
结果
图1. 高容量腺病毒载体（HCAdV）从pAdVFTC中克隆及基因组释放的代表性结果。（A）通过PI-SceI和I-CeuI双酶切从pHM5中释放目的基因（GOI）表达盒。（B）分别用PI-SceI和I-CeuI酶切后纯化的目的基因表达盒，以及经纯化并去磷酸化的pAdVFTC。（C）对含有或不含目的基因的pAdVFTC克隆进行分析性HincII酶切。（D）通过NotI酶切从pAdVFTC-GOI中释放携带目的基因的HCAdV基因组
图2. 氯化铯梯度离心后的代表性结果 (CsCl密度梯度离心 （A） 在进行阶梯梯度离心后（另见步骤1.5）； （B） 经连续梯度离心后（另请参见步骤 1.7）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 超透明超速离心管 | Beckmann Coulter | 344059 | 密度梯度离心 |
| 超速离心机 | Beckmann Coulter | 密度梯度离心 | |
| SW-41 转子 | Beckmann Coulter | 密度梯度离心 | |
| Spectrum Laboratories Spectrapor 透析膜 | VWR | 132129 | 透析管 |
| 即用型透析盒 | Thermo | 66383 | 透析 |
| 氯化铯 | Carl Roth | 8627.1 | 密度梯度离心 |
| LB 培养基 | Carl Roth | X968.3 | 细菌培养基 |
| Tris-HCl 99% | Carl Roth | 9090.3 | 透析缓冲液/裂解缓冲液 |
| 甘油 99.5% | Carl Roth | 3783.1 | 透析缓冲液 |
| MgCl₂ 98.5% | Carl Roth | KK36.2 | 透析缓冲液 |
| NaCl | Carl Roth | 3957.1 | 可选透析缓冲液 |
| KH₂PO₄ | Carl Roth | 3904.2 | 可选透析缓冲液 |
| 蔗糖 | Carl Roth | 9286.1 | 可选透析缓冲液 |
| Na₂HPO₄·2H₂O | Carl Roth | 4984.2 | 可选透析缓冲液 |
| 1.5 ml 离心管 | sarstedt | 72,730,005 | 病毒制剂在 -80 °C 下的保存 |
