小鼠心脏病毒基因递送用于评估基因对心脏功能的影响

摘要

来源: Lu, A., 等. 啮齿类动物心脏中的病毒转基 因表达及心脏心律失常风险评估. J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了一种在小鼠模型中进行超声引导下心肌内注射重组病毒载体的方法。该技术可实现向心脏的靶向基因递送，用于研究转基因表达对心脏功能的影响。

方案

1. 检测啮齿类动物心室组织中的病毒转导基因表达

注意： 储存重组腺病毒或腺相关病毒 (表达目标基因的腺相关病毒（AAV）及相应的对照病毒，例如 Ad-GFP（绿色荧光蛋白）（滴度为 1 x 10¹⁰ 空斑形成单位 [PFU]/mL）或 AAV9-GFP（滴度为 1 x 10¹³ 基因组拷贝 [GC]/mL）（见 材料表)，置于 −80 °C 冰箱中保存。80 °C 冰箱

1. 在病毒注射当天，将病毒置于冰上解冻。用30 G ½针头将表达目标基因的病毒和对照病毒分别吸入两个独立的注射器中（体积 = 50 µL），并在使用前保持在冰上。
   注意：注射器和针头中的任何气泡都必须仔细排除。
2. 对大鼠或小鼠给予丁丙诺啡（大鼠：0.05 mg/kg，小鼠：0.1 mg/kg，皮下注射），一小时后使用3%异氟烷诱导麻醉，并在后续操作中维持异氟烷浓度为2%（以100%氧气为载气，流速为0.5–1.0 L/min）。
3. 用镊子轻轻夹捏动物的身体（例如尾巴），若动物对夹捏无任何身体运动反应，则确认已达到适当麻醉状态。
4. 使用电加热垫维持动物体温在37 °C。使用毛发修剪器剃除胸部区域的毛发。
   注意：使用电加热垫时应谨慎，因其可能存在热量分布不均的情况。
5. 在双眼涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。
6. 将动物保持仰卧位，并使用临床前成像系统（见材料表）对动物心脏进行短轴方向的超声成像。
   注意：以下步骤均在二级生物安全柜中进行，以提供无菌环境。操作中应遵循标准安全规程，包括安全使用针头的措施。
7. 用碘伏或氯己定消毒液与酒精交替以环形方式对动物左下胸部区域进行三次消毒。
8. 在超声成像引导下，将步骤1.1中准备好的含病毒注射器的30 G 1/2针头从动物身体左侧下胸部穿刺进入胸腔。
9. 将针尖推进至左心室前游离壁，缓慢注射10–15 μL病毒。通过超声图像中针尖附近增强的亮度确认注射成功。
   注意：每个注射位点的病毒注射量不得超过15 μL，以防止对心肌组织造成物理损伤。
10. 将针头从心脏中撤出，并插入左心室其他区域，进行第二次和第三次等量病毒注射。
    注意：总注射位点数量由实验设计决定。若需要局灶性转基因表达，仅需一次注射；若需要更广泛的转基因表达，通常需要多个注射位点（三至五个）。
11. 完成注射后，将动物放回笼中。
12. 密切监测动物，直至其恢复足够的意识以维持胸骨卧位，然后将其送回饲养房间。
13. 在接下来的2天内，对动物给予盐酸丁丙诺啡（小鼠：0.1 mg/kg，每日两次；大鼠：0.05 mg/kg，每日两次，皮下注射）。将动物送回动物房，并每日监测是否有异常疼痛或痛苦迹象，如发现异常，应按照机构动物护理委员会的规程进行处理。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30 G ½ PrecisionGlide 针头	Becton Dickinson (BD)	305106
腺相关病毒（表达绿色荧光蛋白(GFP)的AAV9）	Vector Biolabs	7007
腺病毒（Ad-GFP）	Vector Biolabs	1060
生物安全柜（II级）	Microzone Corporation	N/A	型号 #: BK-2-4
布托啡诺	Vetergesic	DIN 02342510
毛发修剪器	WAHL Clipper Corporation	78001
哈密尔顿注射器	Sigma-Aldrich	20701	705 LT，体积 50 μL
加热垫	Life Brand	E12107
异氟烷	Fresenius Kabi Ltd.	M60303
小鼠（Ctnnb1flox/flox）	Jackson Labs	4152
小鼠（αMHC-MerCreMer）	Jackson Labs	5650
眼科软膏	Systane	DIN 02444062
大鼠（Sprague-Dawley，雄性）	Charles River	400
手术刀片	Fine Science Tools	10010-00
手术刀柄	Fine Science Tools	10007-12
VEVO3100 前临床成像系统	VisualSonic Inc.	N/A