利用免疫组织化学染色法验证再细胞化大鼠肝脏中的病毒转导

摘要

来源： Hiller, T. et. al. 利用人肝细胞癌细胞系 HepG2 重建的三维肝脏模型中病毒载体的研究。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了在去细胞化大鼠肝脏模型中进行免疫组织化学染色，以评估病毒介导的基因转移效果。通过抗体检测并结合细胞核染色共定位所确认的报告基因表达，表明病毒在细胞中成功实现了转导。

方案

1. 重细胞化大鼠肝脏的转导

1. 腺相关病毒来源的病毒载体（AAV载体）的大规模生产
   1. AAV载体的制备、纯化与定量：
      1. 简要地，在滚瓶中生产AAV载体，并通过碘克沙醇梯度离心法进行纯化。使用PD10凝胶过滤柱过滤去除残留的碘克沙醇。以基因组AAV DNA作为标准品，通过定量聚合酶链式反应（qPCR）测定AAV载体浓度。
         注意：本研究中使用的自互补假型AAV2/6载体编码翡翠绿色荧光报告蛋白EmGFP，用于示踪转导效率，同时携带一个短发夹RNA（shRNA）表达盒，用于敲低内源性表达的基因（人亲环蛋白B（hCycB），图1）。确保获得足量的6型假型scAAV载体（每肝模型2.7 × 10¹³个AAV载体）。
2. 肝脏模型的转导
   1. 通过加入适量磷酸盐缓冲液（PBS），将AAV载体溶液调整至最终体积5 mL，含2.7 × 10¹³个载体基因组。
   2. 通过移除套管上的管路，将肝脏与培养基循环系统断开。将5 mL注射器连接至门静脉套管，并注入全部AAV载体溶液（5 mL）。
      注意：可选步骤：可加入酚红（5 µg/mL）以追踪AAV载体溶液在肝脏内的分布情况。
   3. 在无灌注条件下孵育1小时。逐步增加流速：先以1.25 mL/min运行10分钟，再以2.5 mL/min运行20分钟，最后以3.75 mL/min运行30分钟。将再细胞化的鼠肝持续培养6天。

2. 转导后再细胞化大鼠肝脏的评估

1. 苏木精和伊红（HE）染色与免疫组织化学分析
   1. 使用手术刀从每个肝叶取样（0.5 × 0.5 × 1.5–2 cm）。
   2. 将样品在4%多聚甲醛（PFA）+ 4%蔗糖溶液中4 °C孵育1.5小时。（注意：PFA具有毒性和致癌性。操作时务必在通风橱内进行，并穿戴适当的防护服。）用PBS洗涤三次（每次洗涤1分钟），然后在4 °C下于8%蔗糖溶液中过夜孵育。
   3. 将包埋介质倒入塑料冷冻模具中，将样品置于包埋介质中，避免产生气泡。加入足够的包埋介质以完全覆盖样品。将包埋好的样品储存在-80 °C，直至后续使用。
   4. 使用冷冻切片机制备冷冻切片（10 µm）。通过苏木精+伊红染色评估再细胞化情况。通过针对目的基因（此处为EmGFP）的免疫组织化学染色评估转导效率。

结果

图1. 本研究中使用的自互补假型AAV2/6载体图谱。 该基因组包含AAV2的反向末端重复序列（ITR），并在CMV启动子控制下编码EmGFP，以及在U6启动子控制下编码一段shRNA。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织基质包埋剂（Tissue-Tek O.C.T.）	Weckert-Labortechnik	600001
冷冻模具 15 × 15 × 5 mm	Sakura	4566
培养箱	Fraunhofer	/