双链DNA定量，使用日立F - 7000荧光分光光度计和PicoGreen染料

摘要

示范的dsDNA定量使用分子探针PicoGreen染料和日立F - 7000型荧光分光光度计，配备酶标仪配件。

摘要

定量，尤其是在低浓度的DNA，是一种与生物应用范围广泛，包括DNA的合成和纯化，如DNA扩增产物的定量诊断应用，DNA分子药物检测的标准，如分子生物学实验的重要任务准备工作。在这段视频中，我们将展示日立F - 7000型荧光分光光度计的功能配备执行双链DNA定量使用QUANT PicoGreen染料试剂盒分子探针与微酶标仪配件。

F - 7000型荧光分光光度计，提供高灵敏度和高速测量。它是一个高度灵活的系统，能够测量荧光，发光和磷光。几种测量模式可供选择，包括波长扫描，扫描时间，测光和3 - D扫描测量。使用300μL的样品量微孔板分光光度计灵敏度范围在50荧光picomoles时，是能够测量为60000海里/分钟的扫描速度。它也有很宽的动态范围高达5个数量级，校准曲线的浓度范围内使用，允许订单的。光学系统采用反射光学最大的能源和灵敏度。标准的波长范围是200至750纳米，可以延长至900纳米，当使用可选的近红外光电倍增管。该系统可以从5至60度摄氏使用一个可选的外部温度控制液体循环酶标仪可选的温度控制。酶标仪允许使用96孔板，96口井的测量速度小于60秒时，使用的动力学模式。

为F - 7000和酶标仪的软件控制也非常灵活。样品可以在任一列或行格式设置，选择样品测量和水井的任意组合可。这使得微孔板的最佳利用。此外，该软件允许进口微板样品配置，在Excel中创建和保存在逗号分隔的值，或"CSV"格式。微孔板测量配置可以保存和回忆说，为方便起见，软件和提高生产力。数据结果可以输出到一个标准的报告，Excel，或一个可选的报表生成器程序。

方案

1。仪器设置

1. 打开分光光度计，让温暖1小时。
2. 使用Excel中创建一个文件的标准和样本数据，如图1所示，它保存在逗号分隔值"CSV"格式。
   
   
   图1。标准品和样品数据。
   
   
3. 设置荧光如下:
   1. 点击按钮，这将打开窗口，如图2所示的分析方法。
      
      
      图2。分析法窗口，"常规"选项卡。
      
      进行以下选择:
      • 在"测量"字段，从下拉菜单选择的光度测定。
      • 在"操作"栏，输入相应的操作员的名字。
      • 有没有必要的"工具"栏位输入信息。这是由软件自动选择。
      • "采样"领域处于非活动状态时使用酶标仪。
      • 输入您可能希望包含在报告中的"备注"字段的任何意见。
      • 在"附件"字段中，输入用于此测试的配件的相关信息。
      • 请注意在右侧窗口中的按钮。
      • "Load"按钮允许加载以前保存的分析方法。
      • "保存"按钮允许更新测试参数的设置或以前保存和加载的分析方法，使用相同的名称。
      • "另存为"按钮允许保存一套合适的名称下的新的测试参数或分析方法。
      现在点击"定量分析"选项卡上，见图3，并做出以下选择。
      
      
      图3。窗口分析方法，定量分析"选项卡。
      
      • 在"定量型"字段，选择波长。这表明将使用选定的波长的荧光读数。
      • 在"校准类型"字段，选择^第一顺序。
      • 在"波长数"字段中，选择1。
      • 在"浓度单位"字段中，输入纳克/毫升。
      • 保留未选中"手动校准"和"力曲线通过零点"框。
      • 在"小数点后的数字"的领域，选择2。
      • 在"低浓度限制"字段中，输入0。
      • 在"上浓度限制字段中，输入10000。
      
      现在点击"工具"选项卡，并做出以下选择 。
      
      
      图4。分析方法"窗口，仪器标签
      
      • 在"数据模式:"字段中，选择荧光。
      • "斩速度"领域处于非活动状态，在这个时候，它是仅用于磷光测量。
      • 在"波长模式"的领域，选择两者WL固定。
      • 在"EX / WL1"字段输入480nm。
      • 在"EM / WL1"字段输入520nm。
      • 在这个时候处于非活动状态下的所有其他领域的EX和EM。
      • 在"前缝"的领域，从下拉菜单选择5.0nm。
      • 在"新兴市场缝隙"字段从下拉菜单选择5.0nm。
      • 保留未选中的复选框前面的"PMT电压1 - 1000V"字段。
      • 在"PMT电压"字段，从下拉菜单选择700V。
      • 在"自动统计钙的数量"字段中选择2。
      • 在"复制"字段中，选择1。
      • 在"集成时间"字段选择0.1秒。/ LI>
      • 在"延迟"字段输入或选择"0"。
      点击"监视器"标签。
      
      
      图5。分析方法"窗口中，监视器标签。
      
      • 在"Y轴"，"最大:"字段中，选择10000
      • 在"Y轴"，"闵:"字段中，选择0。
      • 选择框左侧的"打开数据采集处理后的数据"。
      • 保留未选中框左侧的"数据采集后打印报告"，除非你想有一个读数完成后自动打印报告。
      点击"报告"标签，见图6。
      
      
      图6。分析方法"窗口中，报告选项卡。
      
      • 在"输出"栏，从下拉菜单选择"打印报告。您也可以选择"使用Microsoft Excel"如果你想导出到Excel的数据，或"使用打印生成表"，如果使用可选的附加方案的报告发生器，这将允许生成自定义报告。
      • 点击您想在报告中包括的项目框。
      • 为了节省不同的选项卡的"分析方法"窗口中的所有选定的参数，再次单击"常规"标签，并保存在一个文件名，和他们在一个位置，在那里你可以找到以供将来使用，并点击"确定"按钮关闭此窗口。
      • 这样就完成了设置仪器测试参数。
      • 现在，我们将成立酶标仪。
      • 点击按钮，这将带来顶部的MPR设置窗口。
      选择MPR设置窗口/板标签的标准和样品的井，如图7所示 。
      
      
      图7。 MPR设置窗口中，选项卡板。
      
      • A1位置上点击并拖动鼠标至E1，然后在按钮。这将选择要使用标准的立场。这些职位将突出绿色。
      • 现在，我们需要选择F1至H3样品的位置。单击并拖动鼠标的位置F1出发，H3的位置，然后点击按钮，这将突出显示在黄色这些职位。
      • 然后重复相同的操作位置A2至E3，选择样品测量这些位置。
      • 现在，让我们的负载文件以逗号分隔变量（CSV）文件的标准和样品的信息提前做好准备。
      点击"好信息"选项卡"MPR设置窗口"如图8所示，。
      
      
      图8。 MPR设置"窗口，那么信息"选项卡。
      
      • 然后点击按钮。 Windows资源管理器窗口将打开，在图9所示，这将使定位的"好information.csv"文件，并加载它。
        
        
        图9。载入以及样品信息。
        装载的"好消息"文件后，"好信息"将如下图10所示
        
        
        图10。装样品以及信息。
        

2。 Picogreen检测样品制备

1. 准备加入1毫升20 × TE缓冲液1X TE缓冲液（10毫米的Tris - HCl，1 mM EDTA的）至19毫升DI H _{2 O。}
2. PicoGreen试剂溶液9.95毫升1 × TE缓冲液加入50μL的200 × PicoGreen试剂准备。
3. 准备通过股票双链DNA（100微克/毫升）的系列稀释的标准（LAMBDA双链）。首先准备50μg/ mL的双链DNA溶液，加入25μL股票双链DNA（100微克/毫升）和25μL1 × TE缓冲液。然后准备加入表示卷的dsDNA和缓冲下表列出的标准的解决方案:

   集中的dsDNA	音量的dsDNA	卷缓冲区
   1μg/ mL的	20μL50μg/ mL的双链DNA	980μL1 × TE缓冲液
   0.1微克/毫升	100μL，1μg/ mL的双链DNA	900μL1 × TE缓冲液
   0.01微克/毫升	100μL，0.1μg/ mL的双链DNA	900μL1 × TE缓冲液
   0.001微克/毫升	100μL，0.01μg/ mL的双链DNA	900μL1 × TE缓冲液

3。测量标准和样品的荧光

1. 移液器A1 - E1的成井150μL每个标准96孔板，每图7，并根据下表:

   以及	标准
   A1	1μg/ mL的
   B1	0.1微克/毫升
   C1	0.01微克/毫升
   首长级薪级第1点	0.001微克/毫升
   E1	1 × TE缓冲液

2. 移取150μL的未知样品的成井F1 H3，如图7所示
3. 倒入PicoGreen的解决方案，在步骤1.2制备成设计用于多通道移液器使用低谷。使用多道移液器提供150μLPicoGreen解决方案A1 - H3井。混合解决方案和标准与吸管轻轻地。
4. 将板在暗区，并等待2-5分钟，以发展为反应。

4。代表性的成果

一个良好的校准曲线是使用不同的参数测量软件校准曲线的标准和计算后的F - 7000软件提供的评估。

决定系数表示的衡量标准的适合度和计算的校准曲线。越接近这个值是"1"，更好的测量值和校准曲线拟合。

如果该值是从"1"，标准的，必须重新测量，再准备，或者改变校准曲线的健身。

图11显示了一个校准曲线计算出的决心系数= 0.99993获得的dsDNA使用PicoGreen染料定量，的例子。

图11。双链校准曲线的例子 。

讨论

仔细地吹打在样品制备，以及使用一个稳定的和敏感的荧光分光光度计是为取得良好的和可重复性的结果至关重要。

在本次测试使用的荧光分光光度计的情况下，建议使用300μL，最后的样本量在酶标仪。降低音量降低的灵敏度，量也较大，可能会导致油井之间的交叉污染。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蒸馏 H2O	试剂
Quant-iT Picogreen dsDNA 检测试剂盒，来自 Invitrogen	试剂		P7589
Nalge Nunc 荧光微孔板 p/n 237108	供应		237108
12 通道 Eppendorf 微量移液器	供应		3516677
1000 μL Eppendorf	移液器备件
200 μL Eppendorf 移液器	备件
10 mL 血清移液	管备件
铝箔	备件
移液器吸头	备件 配备
FL Solutions 2.1 设备的 Hitachi F-7000 荧光分光光度计		5J1-0003
F-7000	设备		5J0-0139