使用 Molecular Probes PicoGreen 染料和配备微孔板读板附件的日立 F-7000 荧光分光光度计对双链 DNA 进行定量检测的演示。
本文内容
摘要
摘要
DNA的定量，尤其是在低浓度条件下的定量，是一项具有广泛应用的重要任务，涉及多种生物学应用，包括标准分子生物学实验（如DNA的合成与纯化）、诊断应用（如DNA扩增产物的定量）以及药物制剂中DNA分子的检测。在本视频中，我们将演示配备微孔板读板附件的日立F-7000荧光分光光度计，利用Molecular Probes Quant-it PicoGreen染料试剂盒进行双链DNA（dsDNA）定量的能力。
F-7000 荧光分光光度计可提供高灵敏度和高速测量。该系统具有高度灵活性，能够测量荧光、化学发光和磷光。提供多种测量模式，包括波长扫描、时间扫描、光度测量和三维扫描测量。当在微孔板中使用 300 μL 样品体积时，该仪器对荧光素的检测灵敏度可达 50 皮摩尔，并可实现最高 60,000 nm/分钟的扫描速度。其动态范围宽达五个数量级，可在较宽浓度范围内使用校准曲线。光学系统采用全反射式光学元件，以实现最大能量和最高灵敏度。标准波长范围为 200 至 750 nm，若选用可选的近红外光电倍增管，波长范围可扩展至 900 nm。系统可通过可选的外部温控液体循环器，实现对微孔板读板仪的温度控制，控温范围为 5 至 60 摄氏度。微孔板读板仪支持 96 孔微孔板，使用动力学模式时，96 个孔的测量时间少于 60 秒。
F-7000 和酶标仪的软件控制功能也具有高度灵活性。样品可按列或行格式设置，且可任意选择多个孔位进行样品检测，从而实现对微孔板的最佳利用。此外，该软件支持导入在 Excel 中创建并以逗号分隔值（即“csv”格式）保存的微孔板样品配置文件。微孔板的检测配置可由软件保存并随时调用，便于操作并提高工作效率。检测数据结果可输出为标准报告、Excel 文件，或导入可选的报告生成程序。
方案
1. 仪器设置
- 打开荧光分光光度计，并预热1小时。
- 使用Excel创建一个包含标准品和样品数据的文件，如图1所示，并将其保存为逗号分隔值（csv）格式。
图1. 标准品与样品数据。
- 按以下步骤设置荧光分光光度计：
- 点击
按钮，将打开“分析方法”窗口，如图2所示。
图2. 分析方法窗口，通用选项卡。
进行以下设置：- 在“测量”字段中，从下拉菜单中选择“光度法”。
- 在“操作员”字段中，输入相应操作员的姓名。
- “仪器”字段无需填写，软件将自动选择。
- 使用微孔板读板仪时，“采样”字段不可用。
- 在“备注”字段中输入您希望包含在报告中的任何注释。
- 在“附件”字段中，输入本次测试所用附件的相关信息。
- 注意窗口右侧的按钮。
- “加载”按钮用于加载先前保存的分析方法。
- “保存”按钮用于更新一组已保存并加载的测试参数或分析方法，并使用相同名称覆盖原文件。
- “另存为”按钮允许将一组新的测试参数或分析方法以指定名称保存。
图3. 分析方法窗口，定量选项卡。
- 在“定量类型”字段中，选择“波长”。这表示将使用选定波长进行荧光读数。
- 在“校准类型”字段中，选择1st阶。
- 在“波长数量”字段中，选择1。
- 在“浓度单位”字段中，输入ng/mL。
- 不要勾选“手动校准”和“强制曲线过零点”复选框。
- 在“小数点后位数”字段中，选择2。
- 在“最低浓度限值”字段中，输入0。
- 在“最高浓度限值”字段中，输入10000。
现在点击“仪器”选项卡，并进行以下设置。
图4. 分析方法窗口，仪器选项卡
- 在“数据模式”字段中，选择“荧光”。
- “斩波速度”字段当前不可用，仅用于磷光测量。
- 在“波长模式”字段中，选择“Both WL fixed”（双波长固定）。
- 在“EX / WL1”字段中输入480nm。
- 在“EM / WL1”字段中输入520nm。
- EX和EM下的所有其他字段当前均不可用。
- 在“EX狭缝”字段中，从下拉菜单中选择5.0nm。
- 在“EM狭缝”字段中，从下拉菜单中选择5.0nm。
- 不要勾选“PMT电压 1-1000V”字段前的复选框。
- 在“PMT电压”字段中，从下拉菜单中选择700V。
- 在“自动统计计算次数”字段中选择2。
- 在“重复次数”字段中选择1。
- 在“积分时间”字段中选择0.1s。
- 在“延迟”字段中输入或选择0s。
图5. 分析方法窗口，监测选项卡。
- 在“Y轴”、“最大值”字段中，选择10000。
- 在“Y轴”、“最小值”字段中，选择0。
- 勾选“数据采集后打开数据处理”左侧的复选框。
- 除非您希望在读数完成后自动打印报告，否则不要勾选“数据采集后打印报告”左侧的复选框。
图6. 分析方法窗口，报告选项卡。
- 在“输出”字段中，从下拉菜单中选择“打印报告”。如果您希望将数据导出到Excel，也可以选择“使用Microsoft Excel”；如果使用可选附加程序“报告生成器”以生成自定义报告，则选择“使用打印生成器表格”。
- 勾选您希望包含在报告中的项目对应的复选框。
- 要保存“分析方法”窗口各个选项卡中选定的所有参数，请再次点击“通用”选项卡，将这些参数以文件名保存在便于日后查找的位置，然后点击“确定”按钮关闭此窗口。
- 至此，仪器测试参数设置完成。
- 接下来我们将设置微孔板读板仪。
- 点击
按钮，将调出MPR设置窗口并置于顶层。
图7. MPR设置窗口，板选项卡。
- 点击A1位置并拖动鼠标至E1，然后点击
按钮。这将选定用于标准品的孔位，这些孔位将以绿色高亮显示。 - 现在需要为样品选择F1至H3的孔位。从F1位置开始拖动鼠标至H3位置，然后点击
按钮，这些孔位将以黄色高亮显示。 - 然后对A2至E3位置重复相同操作，以选定用于样品测量的孔位。
- 现在，加载预先准备好的包含标准品和样品信息的逗号分隔变量（csv）文件。
图8. MPR设置窗口，孔信息选项卡。
- 然后点击
按钮。将打开一个Windows资源管理器窗口，如图9所示，可用于定位“孔信息.csv”文件并加载。
图9. 加载孔样品信息。
加载“孔信息”文件后，“孔信息”界面将如图10所示。
图10. 已加载的样品孔信息。
- 点击
2. Picogreen 检测样品制备
- 通过将1 mL 20 X TE缓冲液加入19 mL去离子H2O中，制备1X TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA）。
- 通过将50 μL 200 X PicoGreen试剂加入9.95 mL 1 X TE缓冲液中，制备PicoGreen试剂溶液。
- 通过将双链DNA标准品（Lambda dsDNA）原液（100 μg/mL）进行系列稀释，制备标准溶液。首先，将25 μL双链DNA原液（100 μg/mL）与25 μL 1 X TE缓冲液混合，配制50 μg/mL的双链DNA溶液。然后，按照下表所列体积，将双链DNA溶液与缓冲液混合，制备标准溶液：
双链DNA浓度 双链DNA体积 缓冲液体积 1 μg/mL 20 μL的50 μg/mL双链DNA 980 μL 1 X TE缓冲液 0.1 μg/mL 100 μL的1 μg/mL双链DNA 900 μL 1 X TE缓冲液 0.01 μg/mL 100 μL的0.1 μg/mL双链DNA 900 μL 1 X TE缓冲液 0.001 μg/mL 100 μL的0.01 μg/mL双链DNA 900 μL 1 X TE缓冲液
3. 标准品和样品荧光的测定
- 按照图7所示及下表，将每种标准品各150 μL加入96孔板的A1-E1孔中：
孔 标准品 A1 1 μg/mL B1 0.1 μg/mL C1 0.01 μg/mL D1 0.001 μg/mL E1 1 X TE Buffer - 将未知样品各150 μL加入图7所示的F1至H3孔中
- 将步骤1.2中配制的PicoGreen溶液倒入适用于多通道移液器的槽中。使用多通道移液器向A1-H3孔中每孔加入150 μL PicoGreen溶液。用移液器轻轻混匀溶液与标准品。
- 将板置于避光处，静置2-5分钟以使反应显色。
4. 代表性结果
通过F-7000软件在测定标准品并由软件计算校准曲线后所提供的不同参数，可对校准曲线的质量进行评估。
决定系数反映了测定标准品与计算所得校准曲线的拟合优度。该值越接近“1”，表示测定值与校准曲线的拟合程度越好。
如果该值远偏离“1”，则必须重新测量标准品、重新配制，或调整校准曲线的拟合方式。
图11显示了使用PicoGreen染料对dsDNA进行定量时获得的标准曲线示例，其计算得到的决定系数= 0.99993。
图11. 双链DNA校准曲线示例。
讨论
在样品制备过程中仔细移液，以及使用稳定且灵敏的荧光分光光度计，对于获得良好且可重复的结果至关重要。
对于本实验所用的荧光分光光度计，建议在微孔板读板仪中使用300 μL的最终样品体积。样品体积过低会降低检测灵敏度，而体积过大则可能导致孔与孔之间的交叉污染。
披露
Luis A. Moreno 和 Kendra L. Cox 供职于生产本文所用仪器的美国日立高新技术公司。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 蒸馏水 H2O | 试剂 | |||
| Invitrogen Quant-iT Picogreen dsDNA 定量检测试剂盒 | 试剂 | P7589 | ||
| Nalge Nunc 荧光微孔板，货号 237108 | 耗材 | 237108 | ||
| 12 通道 Eppendorf 移液器 | 耗材 | 3516677 | ||
| 1000 μL Eppendorf 移液器 | 耗材 | |||
| 200 μL Eppendorf 移液器 | 耗材 | |||
| 10 mL 血清移液管 | 耗材 | |||
| 铝箔 | 耗材 | |||
| 移液器吸头 | 耗材 | |||
| Hitachi F-7000 荧光分光光度计，配备 FL Solutions 2.1 软件 | 设备 | 5J1-0003 | ||
| F-7000 荧光分光光度计用微孔板读板附件 | 设备 | 5J0-0139 |
参考文献
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).
重印与许可
