使用四环素响应型慢病毒shRNA表达系统构建条件性基因敲低细胞

摘要

来源： Kubala, M. H. & DeClerck, Y. A. 利用癌细胞系中基因表达的条件性敲低研究单核细胞/巨噬细胞向肿瘤微环境的募集 J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了使用四环素诱导型慢病毒shRNA系统构建条件性基因敲低癌细胞系的方法。内容涵盖了病毒转导、抗生素筛选以及多西环素诱导基因沉默的各个步骤。

方案

1. 稳定转导细胞系的构建
   1. 在12孔板中，将HCT116结肠癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞以每孔50,000个细胞的密度接种于含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（Pen/Strep）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。在37 °C、5% CO₂条件下孵育，直至细胞融合度达到60–70%。
   2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，向癌细胞中加入1 mL含病毒的培养基，并在37 °C、5% CO₂条件下过夜孵育。作为对照，向两孔癌细胞中各加入1 mL新鲜DMEM培养基（含10% FBS和1% Pen/Strep）。
   3. 小心抽吸去除含病毒的培养基。用PBS洗涤细胞，更换为含10%（v/v）无四环素（Tet-free）FBS和1% Pen/Strep的DMEM培养基。
   4. 72小时后，用PBS洗涤细胞，更换为含10% Tet-free FBS、1% Pen/Strep和1 µg/mL嘌呤霉素的DMEM培养基，用于筛选病毒转导的细胞。
      1. 根据所用细胞系的不同，通过在未转导细胞中测试一系列嘌呤霉素浓度（0.1、0.5、1、2和5 µg/mL），选择培养3天后无对照细胞存活的最低浓度，以优化嘌呤霉素筛选浓度。
   5. 在嘌呤霉素存在下培养细胞3–14天，以筛选病毒转导的细胞。作为对照，另准备两孔未转导细胞，一孔加入含嘌呤霉素的培养基，另一孔不加。观察与对照孔相比，病毒转导孔中细胞被嘌呤霉素部分杀灭的情况。
      注意：未转导细胞在嘌呤霉素存在下无法生长。
   6. 在嘌呤霉素抗性的HCT116结肠癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞中验证条件性基因敲低（KD）的效率。
      注意：多西环素的有效浓度因细胞系而异，需进行滴定（通常为100 ng/mL至2 µg/mL）。
      1. 确定对细胞无毒性但能有效下调目标蛋白表达的多西环素浓度。在本方案中，1 µg/mL在体外实验中成功应用。
      2. 在含0.1、1和2 µg/mL多西环素以及不含多西环素的条件下培养细胞72小时。通过Western blot分析检测细胞裂解液中下调蛋白（此处为纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1））的表达水平。将条件性表达短发夹RNA（shRNA）的HCT116和MDA-MB-231细胞与乱序对照细胞进行比较。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
四环素诱导型pLKO-puro慢病毒载体	Addgene	21915
胎牛血清（无四环素）	Omega Scientific	FB-15
psPAX质粒	Addgene	12260
pMD2.G质粒	Addgene	12259
HEK293细胞	ATCC	CRL-1573
磷酸盐缓冲液	Corning	21-031-CV
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Corning	10-013-CV
磷酸盐缓冲盐水（PBS）	Corning	21-031-CV
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）	Sigma-Aldrich	H3375
嘌呤霉素	Sigma-Aldrich	P9620
盐酸多西环素	Sigma-Aldrich	D9891-25g
罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基（RPMI）	Corning	10-040-CV
青霉素-链霉素	Gibco	15140122