来源： Vijayraghavan, S. 和 Kantor, B. 一种用于分裂细胞中CRISPR/Cas9介导基因敲除的整合酶缺陷型慢病毒载体的生产方案。J. Vis. Exp.，（2017）
本视频演示了一种利用蔗糖梯度和蔗糖垫进行两步超速离心的方法，用于从细胞培养上清液中纯化和浓缩病毒颗粒。该方法基于浮力密度实现分离，可回收完整的病毒，适用于后续应用。
方法文章
使用逐步蔗糖离心法制备病毒富集悬液
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2026年9月30日
本文内容
摘要
方案
1. 通过超速离心浓缩病毒颗粒
注意：我们采用双蔗糖纯化法，该方法包括两个步骤：蔗糖梯度步骤和蔗糖垫层步骤（图1）。
- 按以下顺序向锥形超速离心管中加样以形成蔗糖梯度：0.5 mL 70% 蔗糖（溶于1×磷酸盐缓冲液[PBS]），0.5 mL 60% 蔗糖（溶于DMEM），1 mL 30% 蔗糖（溶于Dulbecco改良Eagle培养基[DMEM]），以及2 mL 20% 蔗糖（溶于1× PBS）。
- 小心地将含病毒的上清液加至梯度中。由于来自四个15 cm培养皿的上清液总体积为100 mL，每次离心使用六根超速离心管以处理全部体积的病毒上清液。
- 本步骤所用的每根超速离心管最大容量为30 mL（包括蔗糖体积）。将病毒上清液等量分配至各管中，并至少保留10%的顶部空间以防止溢出。
- 当每次实验使用超过四个15 cm培养皿时，应将每块培养皿的培养液体积调整至约20–22 mL，以便最终汇集的病毒上清液总体积可轻松容纳于六根超速离心管中。
- 超速离心管的填充体积应至少达到其总容量的四分之三，否则在离心过程中可能发生管体破裂，导致样品损失和/或设备损坏。
- 用1× PBS平衡离心管，并在17 °C下以70,000 × g离心2小时
注意：为防止加速过程中破坏蔗糖层，应将超速离心机设置为在离心开始的前3分钟内缓慢加速转子至200 rpm。同样，在离心结束时，应在3分钟内将转子从200 rpm缓慢减速至0 rpm。 - 小心收集30–60%蔗糖组分至洁净离心管中（图1）。向汇集的组分中加入冷的1× PBS，调节总体积至100 mL；通过反复吹打混匀数次。
- 通过将病毒样品小心地铺在蔗糖垫上，进入蔗糖垫层步骤。具体操作为：向每根离心管中加入4 mL 20%蔗糖（溶于1× PBS），然后每管加入约20–25 mL病毒溶液。若离心管填充体积不足四分之三，可用无菌1× PBS补足。
- 如前所述，小心平衡并以70,000 × g在17 °C下离心2小时。倒去上清液，并将离心管倒置于纸巾上使残留液体自然沥干。
- 吸除残留液滴，以彻底去除沉淀中的所有液体。此步骤中，含病毒的沉淀应仅表现为微小的半透明斑点，几乎不可见。
- 向第一根离心管中加入70 µL 1× PBS重悬沉淀，并充分吹打混匀，随后将悬液转移至下一管并如前混合，依次操作直至所有沉淀完全重悬。
- 用额外50 µL冷的1× PBS冲洗各离心管，并如前混匀。确保最终悬液的总体积约为120 µL，且呈轻微乳白色；在台式微量离心机中以10,000 × g离心30秒以澄清悬液。
- 将上清液转移至新的微量离心管中，分装为10 µL每份，并于-80 °C保存。
注意：避免对慢病毒样品进行反复冻融。除必需离心外，其余操作应尽量在组织培养生物安全柜或指定的组织培养室内进行，并采取适当的生物安全防护措施。
结果
图1： 使用双蔗糖梯度法浓缩病毒颗粒。从上清液（SN）中收集的病毒颗粒被加载到蔗糖梯度中。采用70%、60%、30%和20%的蔗糖溶液建立梯度。离心后，从30–60%蔗糖组分中收集的颗粒进一步加载到20%蔗糖垫上并进行沉淀。最终含有纯化病毒颗粒的沉淀用1x PBS重悬，用于后续实验。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 设备 | |||
| Optima XPN-80 超速离心机 | Beckman Coulter | A99839 | |
| Allegra 25R 台式离心机 | Beckman Coulter | 369434 | |
| 锥底超速离心管 | Seton Scientific | 5067 | |
| 锥形管适配器 | Seton Scientific | PN 4230 | |
| SW32Ti 摆桶转子 | Beckman Coulter | 369650 | |
| 50 mL 锥形离心管 | Corning | 430291 | |
| 组织培养移液管，25 mL | Corning | 4489 |
