使用酶联免疫吸附测定法评估慢病毒滴度

摘要

来源：Vijayraghavan, S.，等。用于CRISPR/Cas9介导分裂细胞基因敲除的整合酶缺陷型慢病毒载体的制备方案。 J. Vis. Exp. (2017)。

本视频演示了使用p24酶联免疫吸附试验（ELISA）来估算慢病毒载体的病毒滴度。该检测方法包括裂解病毒颗粒以释放p24蛋白，利用特异性抗体捕获p24，并通过辣根过氧化物酶标记系统进行检测，产生可测量的颜色变化。通过将样品的吸光度值与标准曲线比较，可定量病毒滴度。

方案

1. 病毒滴度的测定

1. p24（人免疫缺陷病毒（HIV）-1 p24 衣壳蛋白）酶联免疫吸附测定（ELISA）方法说明：该检测使用高结合力96孔板，按照美国国立卫生研究院艾滋病疫苗计划（NIH AIDS Vaccine Program）提供的HIV-1 p24抗原捕获检测试剂盒说明书（见材料表）并稍作修改进行。
   1. 次日，用200 µL含0.05% Tween 20的冷PBS（PBS-T溶液）洗涤各孔三次。每孔加入100 µL单克隆抗p24抗体（以1×PBS按1:1500稀释），在4 °C下包被过夜。
   2. 为消除非特异性结合，用200 µL含1% BSA的PBS在室温下封闭1小时以上；然后用200 µL含0.05% Tween 20的冷PBS（PBS-T溶液）洗涤三次。
   3. 样品制备：对于浓缩的载体样品，取1 µL样品加入89 µL dd-H2O和10 µL Triton X-100（终浓度为10%），进行100倍稀释。对于未浓缩的样品，取10 µL样品加入80 µL dd-H2O和10 µL Triton X-100（终浓度为10%），制备成10倍稀释样品。说明：此步骤的样品可在-20 °C长期保存以备后续使用。
   4. 通过2倍系列稀释法配制HIV-1标准品（起始浓度为5 ng/mL）。
   5. 将浓缩样品（来自已预稀释1:100的储备液）用添加0.2% Tween 20和1% BSA的RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640培养基）稀释，制备成1:10,000、1:50,000和1:250,000的稀释度。将未浓缩样品（来自已预稀释1:10的储备液）用添加0.2% Tween 20和1% BSA的RPMI 1640稀释，制备成1:500、1:2,500和1:12,500的稀释度。
   6. 每份样品设三个复孔加样至孔板中，在4 °C下孵育过夜。
   7. 次日，洗涤孔板六次，每孔加入100 µL多克隆兔抗p24抗体（用含10% FBS、0.25% BSA和2%正常小鼠血清（NMS）的RPMI 1640按1:1000稀释），在37 °C孵育4小时。
   8. 同上法洗涤六次，每孔加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（用含5%正常山羊血清、2% NMS、0.25% BSA和0.01% Tween 20的RPMI 1640按1:10,000稀释），在37 °C孵育1小时。
   9. 同上法洗涤孔板，室温下加入TMB（3,3′,5,5′-四甲基联苯胺）过氧化物酶底物，孵育15分钟。
   10. 加入100 µL 1 N HCl终止反应。使用吸光度读板仪在450 nm处测定样品吸光度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
p24 ELISA 试剂
单克隆抗 p24 抗体	NIH 艾滋病研究与参考试剂计划	3537
HIV-1 标准品	NIH 艾滋病研究与参考试剂计划	SP968F
多克隆兔抗 p24 抗体	NIH 艾滋病研究与参考试剂计划	SP451T
辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG	Sigma Aldrich	12-348	工作浓度 1:1500
正常小鼠血清，无菌，500 mL	Equitech-Bio	SM30-0500
山羊血清，无菌，10 mL	Sigma	G9023	工作浓度 1:1000
TMB 过氧化物酶底物	KPL	5120-0076	工作浓度 1:10,000