通过质粒转染生成重组腺相关病毒

摘要

来源：Ding, J., et al. 制备rAAV9在小鼠心脏中过表达或敲低基因. J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了通过质粒转染哺乳动物细胞来生产重组腺相关病毒颗粒的过程。重点介绍了Rep、Cap和辅助蛋白的协调表达，这些蛋白驱动病毒基因组在细胞核内的复制和衣壳组装。

方案

1. 使用重组腺相关病毒9型（rAAV9）质粒转染HEK293细胞

1. 制备1 µg/µl的线性聚乙烯亚胺（PEI）溶液。将PEI粉末溶解于已加热至70–80 °C的无内毒素dH₂O中。冷却至室温后，用1 M HCl将溶液中和至pH 7.0。使用0.22 µm滤器过滤除菌。将1 µg/µl的PEI储存液分装（1,400 µl/管），并于-20 °C保存。
2. 在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293细胞。将细胞置于37 °C、含5 ± 0.5%二氧化碳（CO₂）的培养箱中培养。
3. 第0天，通过将融合度>90%的细胞以1:2比例传代，在转染前18–20小时将HEK293细胞接种于十个150-mm培养皿中。
   注意：第1天时，细胞融合度应达到90%。
4. 第1天，使用PEI将rAAV9质粒（例如rAAV9.cTNT::GFP或rAAV6.U6::shRNA构建体）、Ad-Helper质粒和AAV-Rep/Cap质粒共转染至HEK293细胞中。
   1. 对于十个融合度为90%的细胞培养皿，取70 µg AAV-Rep/Cap质粒、70 µg rAAV9质粒和200 µg Ad-Helper质粒，加入50-ml离心管中混匀。
   2. 若细胞融合度较低，应按比例调整DNA用量。例如，若细胞融合度为75%，则将DNA用量按比例减少（即步骤1.4.1所示用量的75/90）：取70 × 75/90 = 58.3 µg AAV-Rep/Cap质粒、70 × 75/90 = 58.3 µg rAAV9质粒和200 × 75/90 = 166.7 µg Ad-Helper质粒，加入50-ml离心管中混匀。
   3. 向该50-ml离心管中加入49 ml室温DMEM（不含FBS），充分混匀。
   4. 加入1,360 µl PEI溶液，使PEI与DNA的体积与质量比（v/w）为4:1。充分混匀后，在室温下孵育15–30分钟。
   5. 将步骤1.4.4中制备的混合物各取5 ml加入每个150-mm培养皿中（共十个培养皿，总计50 ml混合物）。
5. 将细胞置于37 °C、含5 ±0.5% CO₂的培养箱中培养60–72小时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乙烯亚胺，线性（分子量 25,000）	Polysciences, Inc.	#23966-2
聚丙烯管，36.2 ml，25 x 87 mm（数量 56）	Beckman Coulter, Inc	# 362183
DMEM 培养基	Fisher Scientific	SH30243FS
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11150
rAAV9 载体	Penn Vector Core	P1967