从转染的人肾细胞中纯化重组病毒颗粒

摘要

来源：Ding, J. et. al., 制备rAAV9以在小鼠心脏中过表达或敲低基因。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了从转染的人肾细胞中纯化重组病毒颗粒的过程。通过冻融裂解释放病毒，并利用碘克沙醇梯度结合嵌段共聚物辅助过滤法进行纯化。

方案

1. 使用重组腺相关病毒9型（rAAV9）质粒转染HEK293细胞
   1. 配制1 µg/µl的线性聚乙烯亚胺（PEI）溶液。将PEI粉末溶于已加热至70–80 °C的无内毒素dH₂O中。冷却至室温（RT）后，用1 M盐酸（HCl）调节pH至7.0。用0.22 µm滤器过滤除菌。将1 µg/µl的PEI储备液分装（1,400 µl/管），于-20 °C保存。
   2. 在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293细胞。将细胞置于37 °C、5 ± 0.5%二氧化碳（CO₂）的培养箱中培养。
   3. 第0天，将>90%融合度的细胞按1:2比例传代，于十个150-mm培养皿中接种，转染前培养18–20小时。
      注意：第1天时，细胞应达到约90%融合度。
   4. 第1天，使用PEI将rAAV9质粒（例如rAAV9.cTNT::GFP或rAAV6.U6::shRNA构建体）、Ad-Helper质粒和AAV-Rep/Cap质粒共转染至HEK293细胞中。
      1. 对于10个90%融合度的培养皿，取70 µg AAV-Rep/Cap质粒、70 µg pfrAAV9质粒和200 µg Ad-helper质粒，加入50-ml离心管中混合。
      2. 若细胞融合度较低，则按比例调整DNA用量。例如，若细胞融合度为75%，则将DNA用量按比例减少（为步骤2.4.1所示量的75/90）：取70 × 75/90 = 58.3 µg AAV-Rep/Cap质粒、70 × 75/90 = 58.3 µg rAAV9质粒和200 × 75/90 = 166.7 µg Ad-Helper质粒，于50-ml离心管中混合。
      3. 向上述50-ml管中加入49 ml室温DMEM（不含FBS），充分混匀。
      4. 加入1,360 µl PEI溶液，使PEI与DNA的体积/质量比（v/w）为4:1。充分混匀，室温孵育15–30分钟。
      5. 将步骤1.4.4配制的混合液5 ml加入每个150-mm培养皿中（共10个培养皿，总计50 ml）。
   5. 将细胞置于37 °C、5 ± 0.5% CO₂的培养箱中继续培养60–72小时。
2. 转染后HEK293细胞的收获及rAAV9载体的纯化
   1. 转染后60–72小时收获细胞。用培养基反复吹打，使细胞从培养皿中脱落并悬浮。将所有细胞悬液转移至无菌50-ml离心管中。
   2. 以500 × g离心5分钟。弃上清，每管用5 ml磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀，并将所有细胞悬液合并至一个50 ml离心管中。
   3. 以500 × g离心5分钟。弃上清。此时可将细胞沉淀于-80 °C保存，或立即按步骤2.4–2.15进行AAV的纯化。
   4. 配制裂解缓冲液：150 mM氯化钠（NaCl）和20 mM三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl，pH 8.0）。用0.22 µm滤器过滤除菌，4 °C保存。
   5. 用10 ml裂解缓冲液重悬细胞沉淀。
   6. 将裂解液于-80 °C或干冰/乙醇浴中冷冻，随后在37 °C解冻。涡旋振荡1分钟。重复冻融3次。
   7. 向解冻后的裂解液中加入氯化镁（MgCl₂）溶液，使裂解液中MgCl₂终浓度为1 mM。加入核酸酶至终浓度250 U/ml。37 °C孵育15分钟，以降解DNA/蛋白聚集体。
      注意：若经核酸酶或内切酶处理后DNA/蛋白聚集体仍未完全溶解，可用Dounce匀浆器匀浆20次。
   8. 4 °C下以4,800 × g离心20分钟。收集上清液。
   9. 同时，配制碘克沙醇梯度溶液：
      1. 通过混合5 ml 10x PBS、0.05 ml 1 M MgCl₂、0.125 ml 1 M氯化钾（KCl）、10 ml 5 M NaCl和12.5 ml密度梯度介质，配制17%梯度溶液。用H₂O定容至50 ml。
      2. 通过混合5 ml 10x PBS、0.05 ml 1 M MgCl₂、0.125 ml 1 M KCl、20 ml密度梯度介质和0.2 ml 0.5%（w/v）酚红，配制25%溶液。用H₂O定容至50 ml。
      3. 通过混合5 ml 10x PBS、0.05 ml 1 M MgCl₂、0.125 ml 1 M KCl和33.3 ml密度梯度介质，配制40%溶液。用H₂O定容至50 ml。
      4. 通过混合0.05 ml 1 M MgCl₂、0.125 ml 1 M KCl、50 ml密度梯度介质和0.1 ml 0.5%（w/v）酚红，配制60%溶液。
   10. 使用针头和注射器，从离心管底部开始，依次加入5 ml 17%、5 ml 25%、5 ml 40%和5 ml 60%的碘克沙醇溶液。将步骤3.8获得的全部裂解液（14–16 ml）小心加于梯度顶部。从下至上依次为：60%、40%、25%、17%和裂解液层。用裂解缓冲液补满离心管，并加盖密封。
   11. 16 °C下以185,000 × g离心90分钟。
   12. 用注射器收集病毒组分（40%层）。将针头（21号）插入40%与60%层交界处，仅吸取40%层。
       注意：避免吸入25%层。
   13. 将病毒组分与灭菌的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物PBS溶液（10%聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物储备液以1:10,000比例稀释于PBS中）混合，总体积至15 ml。将混合液加入超滤管（截留分子量=100 kD）。4 °C下以2,000 × g离心30分钟。
   14. 弃去滤出液。向超滤管中重新加入聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物PBS溶液至总体积15 ml。4 °C下以2,000 × g离心20分钟。重复此步骤两次。收集纯化的rAAV9病毒（滤膜上方组分）。
   15. 将滤管中纯化的rAAV9转移至1.7-ml离心管中。根据AAV体积和滴度，分装为100–400 µl/管，于-80 °C保存。
       注意：避免反复冻融。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乙烯亚胺，线性（分子量 25,000）	Polysciences, Inc.	#23966-2
聚丙烯管，36.2 ml，25 x 87 mm（数量 56）	Beckman Coulter, Inc	# 362183
核酸酶，超纯	SIGMA	#E8263-25KU
密度梯度介质（碘克沙醇）	SIGMA	#D1556-250ML
带有 Ultracel-100 膜的离心过滤单元	EMD Millipore Corporation	#UFC910008
实验室移液针，90° 钝端，14 号规格，长 6 英寸，镍涂层接头	SIGMA	#CAD7942-12EA
泊洛沙姆 188 溶液（Pluronic® F-68 溶液）	SIGMA	P5556-100ML
蛋白酶 K	SIGMA	3115828001
DNase I	Roche	10104159001
离心机	Thermo Scientific	75004260
离心系统	Beckman Coulter	363118
超速离心机	Beckman Coulter
DMEM 培养基	Fisher Scientific	SH30243FS
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11150
rAAV9 载体	Penn Vector Core	P1967