从转染的人肾细胞中纯化重组病毒颗粒

摘要

来源：Ding, J. et. al., 制备rAAV9以在小鼠心脏中过表达或敲低基因。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了从转染的人肾细胞中纯化重组病毒颗粒的过程。通过冻融裂解释放病毒，并利用碘克沙醇梯度结合嵌段共聚物辅助过滤法进行纯化。

方案

1. 使用重组腺相关病毒9型（rAAV9）质粒转染HEK293细胞
   1. 配制1 µg/µl的线性聚乙烯亚胺（PEI）溶液。将PEI粉末溶于已加热至70–80 °C的无内毒素dH₂O中。冷却至室温（RT）后，用1 M盐酸（HCl）调节pH至7.0。用0.22 µm滤器过滤除菌。将1 µg/µl的PEI储备液分装（1,400 µl/管），于-20 °C保存。
   2. 在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293细胞。将细胞置于37 °C、5 ± 0.5%二氧化碳（CO₂）的培养箱中培养。
   3. 第0天，将>90%融合度的细胞按1:2比例传代，于十个150-mm培养皿中接种，转染前培养18–20小时。
      注意：第1天时，细胞应达到约90%融合度。
   4. 第1天，使用PEI将rAAV9质粒（例如rAAV9.cTNT::GFP或rAAV6.U6::shRNA构建体）、Ad-Helper质粒和AAV-Rep/Cap质粒共转染至HEK293细胞中。
      1. 对于10个90%融合度的培养皿，取70 µg AAV-Rep/Cap质粒、70 µg pfrAAV9质粒和200 µ....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乙烯亚胺，线性（分子量 25,000）	Polysciences, Inc.	#23966-2
聚丙烯管，36.2 ml，25 x 87 mm（数量 56）	Beckman Coulter, Inc	# 362183
核酸酶，超纯	SIGMA	#E8263-25KU
密度梯度介质（碘克沙醇）	SIGMA	#D1556-250ML
带有 Ultracel-100 膜的离心过滤单元	EMD Millipore Corporation	#UFC910008
实验室移液针，90° 钝端，14 号规格，长 6 英寸，镍涂层接头	SIGMA	#CAD7942-12EA
泊洛沙姆 188 溶液（Pluronic® F-68 溶液）	SIGMA	P5556-100ML
蛋白酶 K	SIGMA	3115828001
DNase I	Roche	10104159001
离心机	Thermo Scientific	75004260
离心系统	Beckman Coulter	363118
超速离心机	Beckman Coulter
DMEM 培养基	Fisher Scientific	SH30243FS
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11150
rAAV9 载体	Penn Vector Core	P1967