通过逆转录病毒转导病毒癌基因使内皮细胞永生化

摘要

来源：McAllister, S. C., Hanson, R. S., 等．一种用于研究卡波西肉瘤相关疱疹病毒诱导细胞转化的体外模型．J. Vis. Exp.(2017)

本视频展示了利用HPV16 E6/E7癌基因对原代内皮细胞进行逆转录病毒转导的过程。整合的癌基因可使p53和Rb肿瘤抑制因子失活，从而延长细胞寿命。通过G418筛选富集转导细胞，获得可用于转化研究的永生化内皮细胞培养物。

方案

利用 E6 和 E7 乳头瘤病毒基因转导内皮细胞（EC）

注意：我们通常使用标准组织培养瓶培养原代内皮细胞（EC）。然而，如果原代内皮细胞生长状况不理想，则应考虑使用商用培养瓶。

1. 在加湿的培养箱中，于37 °C、5% CO2条件下，将原代人皮肤微血管或淋巴管内皮细胞（EC）接种于含内皮细胞生长培养基（EGM；包含添加了EGM-2 BulletKit [含胎牛血清、氢化可的松、人成纤维细胞生长因子-B、血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、抗坏血酸、人表皮生长因子、抗生素和肝素] 的内皮细胞基础培养基[EBM]）的T75细胞培养瓶中，培养至约50%融合度。 37 °C 加5% CO₂₂ 在T75细胞培养瓶中，使用内皮细胞生长培养基（EGM；包含内皮细胞基础培养基[EBM]并添加EGM-2 BulletKit[含胎牛血清、氢化可的松、人成纤维细胞生长因子-B、血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、抗坏血酸、人表皮生长因子、抗生素和肝素]），于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中培养至约50%汇合度。
2. 进行转导时，将PA317 LXSN 16E6E7细胞在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中，置于T150细胞培养瓶内，用添加10%胎牛血清和抗菌剂的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养至约90%汇合度。随后加入16 mL培养基过夜孵育。 37 °C 加5% CO₂₂ 在含10%胎牛血清和抗菌素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于T150细胞培养瓶内于37 °C、5% CO₂培养箱中培养至约90%汇合度。随后在16 mL培养基中过夜孵育。
3. 通过在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，澄清 PA317 培养基。 × g，室温下离心5分钟。
4. 从内皮细胞培养物中移除EGM，加入12 mL澄清的PA317培养基覆盖细胞，于37 °C、5% CO₂条件下孵育4小时。
   注意： 将 16 mL 条件培养基在 300 × g 离心 5 分钟 × × g 离心 5 分钟可形成致密沉淀，后续小心移除 12 mL 澄清上清液时不会扰动沉淀。然而，若担心 PA317 LXSN 16E6E7 细胞会转入原代 EC 培养物中（包装细胞系会迅速过度生长并超过 EC），则可在转移前通过 0.45 µm 滤膜过滤条件培养基上清液 0.45 µm 转移前可进行过滤。
5. 更换6 mL PA317培养基为新鲜EGM，过夜培养。
6. 用12 mL新鲜EGM重新换液，继续培养48小时。
7. 传代培养内皮细胞（EC）时，移除培养基，用12 mL无阳离子磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，加入3 mL商品化酶解解离液（如TrypLE），于37 °C孵育3分钟。 37 °C 3 分钟。
8. 将细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中，于室温下以300 × g离心5分钟。 × g，室温下离心5分钟。将所得细胞沉淀重悬于新鲜EGM中，并均分为3份 × 每瓶T75培养瓶中加入终体积12 mL的EGM。
9. 为筛选转导了 E6 和 E7 的内皮细胞，加入 G418 至终浓度为 200 µg/mL 经过两次传代后，可将转导的内皮细胞接种用于感染实验，或在液氮中冻存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BCBL-1 细胞	NIH 艾滋病试剂项目	3233
PA317 细胞	ATCC	CRL-2203
新生儿皮肤微血管内皮细胞	Lonza	CC-2505
EBM-2 基础培养基	Lonza	CC-3156
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
RPMI
DMEM
含钙和镁的 PBS