通过荧光原位杂交确定宿主细胞中病毒RNA的分布

摘要

来源：Vallery, T. K. & Steitz, J. A. KSHV感染细胞中特定基因产物的定量荧光原位杂交（FISH）与免疫荧光（IF）。J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了荧光原位杂交技术，用于在病毒感染细胞中可视化病毒RNA。该方法概述了探针杂交、信号扩增和共聚焦成像的相关步骤。

方案

1. 病毒RNA的固定、杂交与可视化

1. 移除培养基和多余的细胞。在整个实验过程中，使用真空抽吸法去除溶液，使用移液枪轻柔地加入溶液。
   注意：可通过在玻璃巴斯德吸管上套一个200 µL移液枪吸头来降低真空强度。每次洗涤步骤之间应更换移液枪吸头，以防止污染。每次洗涤步骤都必须迅速完成，因为细胞绝不能干燥。
2. 立即在冰上用预冷的4%多聚甲醛/PBS（磷酸盐缓冲盐水）固定细胞30分钟。用200 µL预冷至4 °C的1× PBS洗涤细胞三次，每次在室温或冰上孵育5分钟。
   1. 在冰上用200 µL预冷的0.5% Triton-X/PBS处理固定后的细胞10分钟，或在4 °C下用750 µL预冷的70%乙醇处理1小时（最小）至7天（最大）以进行透化。
      注意：除非另有说明，本实验方案中的所有洗涤步骤均以相同方式进行。70%乙醇会削弱腔室与载玻片之间的粘合力，便于后续分离，同时也能显著暂停实验流程。尽管如此，仍需在腔室载玻片周围使用石蜡膜以减少蒸发，并每隔约8小时检查每个腔室中乙醇的液面高度。70%乙醇还能使细胞变平，从而获得更清晰的图像，而Triton-X不会使细胞脱水，也不会改变细胞的尺寸。
3. 小心移除腔室，防止载玻片破裂。
   注意：使用新的移除工具或残留粘合剂极少的工具，并轻柔地将腔室取下，以避免载玻片破裂。使用70%乙醇作为透化试剂处理4小时可显著降低破裂的可能性。若发生破裂，请继续在未受影响的腔室上进行实验，并注意密封不完全的载玻片氧化速率更高（即储存寿命缩短）。
4. 用2× SSC（柠檬酸钠-氯化钠溶液）洗涤细胞一次，然后每腔室加入45 µL杂交溶液，该溶液包含50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、2× SSC、0.1%牛血清白蛋白（BSA）、500 µg/mL鲑精脱氧核糖核酸（DNA）、125 µg/mL E. coli 转运RNA（tRNA）以及1 mM 钒酰核糖核苷复合物。在湿润室中37 °C孵育1小时，湿润室可使用直径150 mm的培养皿并放入湿润的无菌擦拭纸。
   注意：至少在使用前一小时新鲜配制杂交溶液。先将硫酸葡聚糖溶于水中，频繁涡旋，并在37 °C水浴中孵育。
5. 计算每腔室35 µL杂交溶液中达到建议浓度25 µM所需的寡核苷酸量。根据需要调整反义寡核苷酸的浓度。加入蒸馏水至寡核苷酸中，使变性体积达到10 µL。
   注意：标记反应完成后，寡核苷酸保存在淬灭溶液中，该溶液包含0.18 M二甲胂酸钾、23 mM Tris-HCl、0.23 mg/mL BSA、4.5 mM CoCl₂、18 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、2.7 mM磷酸钾、6.8 mM KCl、45 µM 2-巯基乙醇、0.02% Triton X-100和2%甘油。这些浓度足够高，加水稀释后变性溶液的浓度接近1× TE（10 mM Tris-HCl和1 mM EDTA），这是标准的寡核苷酸变性缓冲液。
6. 将地高辛（DIG）和/或Alexa Fluor 594标记的寡核苷酸在95 °C变性5分钟。然后每预定腔室向变性后的寡核苷酸中加入35 µL新鲜杂交溶液。若进行双重荧光原位杂交（FISH），可将两组反义寡核苷酸同时变性并杂交。
7. 去除预杂交溶液，然后将含有标记寡核苷酸的杂交溶液加至细胞上。在37 °C湿润室中避光（用锡箔纸包裹）过夜孵育。
   注意：孵育时间应不少于10小时且不超过24小时。
8. 次日，在37 °C下用2× SSC洗涤细胞两次，每次10分钟；然后在25 °C下用1× SSC洗涤两次，每次10分钟。
9. 在冰上用预冷的4%多聚甲醛/1× PBS固定细胞10–15分钟。然后用PBS洗涤细胞三次，并在4 °C下用预冷的70%乙醇透化1小时，或用预冷的0.5% Triton-X/1× PBS透化10分钟。
10. 在4 °C下用预冷的含0.1% BSA/1× PBS溶液中以1:200稀释的地高辛（DIG）–异硫氰酸荧光素（FITC）抗体孵育细胞1小时。去除抗体溶液后，用1× PBS洗涤三次。
11. 在4 °C下用预冷的4%多聚甲醛/1× PBS固定10–15分钟，然后用1× PBS洗涤三次。
12. 在冰上用含0.4 µg/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的预冷0.5% Triton-X/1× PBS溶液孵育细胞15分钟，然后用1× PBS洗涤三次。
13. 封片（可选加入荧光微珠）并使用封片剂。然后用透明指甲油将盖玻片密封至载玻片上。
14. 使用共聚焦显微镜，在完成实验后一小时至一周内，以630倍放大倍数采集样本图像。多层涂抹指甲油以密封盖玻片，并通过降低氧化速率延长荧光团寿命。
    注意：不要使用含DAPI的封片剂。采集图像时，应在每张图像上包含比例尺，以便后续定量分析。荧光微珠可作为不同载玻片和样本制备之间荧光强度的对照。为进行二维（2D）定量分析，应在细胞中段层面采集图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗DIG-FITC	Jackson Lab Immunologicals	200-092-156
硫酸葡聚糖	Sigma Aldrich	D8906	分子生物学级
DIG-寡核苷酸加尾试剂盒	Sigma Roche	#03353583910	第二代
八孔载玻片	Nunc Lab Tek II	#154453	蓝色密封可增强表面张力，也可使用透明凝胶进行分隔。
甲酰胺	Sigma Aldrich	F9037	分子生物学级
钒酰核糖核苷复合物	NEB	S1402S