通过荧光原位杂交确定宿主细胞中病毒RNA的分布

摘要

来源：Vallery, T. K. & Steitz, J. A. KSHV感染细胞中特定基因产物的定量荧光原位杂交（FISH）与免疫荧光（IF）。J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了荧光原位杂交技术，用于在病毒感染细胞中可视化病毒RNA。该方法概述了探针杂交、信号扩增和共聚焦成像的相关步骤。

方案

1. 病毒RNA的固定、杂交与可视化

1. 移除培养基和多余的细胞。在整个实验过程中，使用真空抽吸法去除溶液，使用移液枪轻柔地加入溶液。
   注意：可通过在玻璃巴斯德吸管上套一个200 µL移液枪吸头来降低真空强度。每次洗涤步骤之间应更换移液枪吸头，以防止污染。每次洗涤步骤都必须迅速完成，因为细胞绝不能干燥。
2. 立即在冰上用预冷的4%多聚甲醛/PBS（磷酸盐缓冲盐水）固定细胞30分钟。用200 µL预冷至4 °C的1× PBS洗涤细胞三次，每次在室温或冰上孵育5分钟。
   1. 在冰上用200 µL预冷的0.5% Triton-X/PBS处理固定后的细胞10分钟，或在4 °C下用750 µL预冷的70%乙醇处理1小时（最小）至7天（最大）以进行透化。
      注意：除非另有说明，本实验方案中的所有洗涤步骤均以相同方式进行。70%乙醇会削弱腔室与载玻片之间的粘合力，便于后续分离，同时也能显著暂停实验流程。尽管如此，仍需在腔室载玻片周围使用石蜡膜以减少蒸发，并每隔约8小时检查每个腔室中乙醇的液面高度。70%乙醇还能使细胞变平，从而获得更清晰的图像，而Triton-X不会使细胞脱水，也不会改变细胞的尺寸。
3. 小心移除腔室，防止载玻片破裂。
   注意：使用新的移除工具或残留粘合剂极少的工具，并轻柔地将....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗DIG-FITC	Jackson Lab Immunologicals	200-092-156
硫酸葡聚糖	Sigma Aldrich	D8906	分子生物学级
DIG-寡核苷酸加尾试剂盒	Sigma Roche	#03353583910	第二代
八孔载玻片	Nunc Lab Tek II	#154453	蓝色密封可增强表面张力，也可使用透明凝胶进行分隔。
甲酰胺	Sigma Aldrich	F9037	分子生物学级
钒酰核糖核苷复合物	NEB	S1402S