随时间测量溶原性细菌中噬菌体的自发诱导

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摘要

来源：Krishnamurthi, R., et al. 通过转录组学研究温和噬菌体对其溶原菌的影响。J. Vis. Exp. (2024)。

本视频展示了溶原性细菌中噬菌体自发诱导的时间序列计数方法 铜绿假单胞菌 通过定量测定随时间变化的可存活细菌细胞（CFUs）和感染性噬菌体颗粒（PFUs）。通过在生长过程中定时取样，并分析菌落和噬斑的形成情况，该方法可揭示自发诱导水平最低的时间点。这有助于确定受裂解循环干扰最小的下游转录组学分析的最佳取样时间点。

方案

1. 自发诱导的时序直接计数（图1）

设置溶原菌（例如，携带 LES（利物浦流行株（Liverpool Epidemic Strain，LES）噬菌体）的铜绿假单胞菌 PAO1 溶原菌）和指示宿主（PAO1-RifR）（利福平抗性的铜绿假单胞菌 PAO1）的过夜种子培养物，方法是将单个菌落接种于 5 mL LB 培养基（Luria–Bertani 肉汤）中，于 37 °C、180 rpm 振荡培养 18–24 小时。^R（利福平抗性） 铜绿假单胞菌 PAO1）通过将单个菌落接种于5 mL LB（Luria–Bertani肉汤）中，并在37 °C、180 rpm振荡条件下培养18–24小时 37 °C 以180 rpm振荡培养（18–24 h）。
通过将过夜培养物按1:100的比例接种至100 mL LB培养基中，制备新鲜的溶原菌和指示菌培养物，并在37 °C、180 rpm振荡条件下培养 37 °C 振荡培养（180 rpm）。
1. 通过测量OD600和采用Miles Misra技术进行活菌计数，监测溶原菌的生长情况。₆₀₀ 并使用 Miles-Misra 法进行活菌计数。具体操作为：从接种时刻起，每小时从每种溶原菌培养物中取 1 mL 样品，持续 8 小时。
2. 收集后立即进行连续稀释，方法是将样品加入 100 µL 样品的 900 µL 相应培养基。充分涡旋振荡至最大速度，每次稀释后弃去移液 tip，继续进行 10⁻¹ 至 10⁻⁹ 的梯度稀释。⁻¹ 至 10⁻⁹.
3. 点样 10 µL 将所需稀释液各取10 µL，每种做三个重复点样于LB琼脂平板上，待其干燥后，于37 °C培养18–24 h。 37 °C 18–24 小时。
4. 为计算活菌数量，需选择菌落数量易于计数的稀释度。计数每个点样区域的菌落数，然后使用以下公式：
  
  注意： 随着溶原菌培养物的生长，自发诱导将产生具有活性的噬菌体颗粒。感染性噬菌体的产生意味着溶原菌群体的转录组中已混入裂解复制周期相关的基因表达信号，这些信号来源于裂解性噬菌体复制及其相应的宿主细胞反应。因此，确定溶原细胞与游离感染性噬菌体颗粒比例最高的生长阶段至关重要，以便最大限度地减少数据集中由裂解性噬菌体转录组产生的背景转录噪声。
为定量各时间点样品中的感染性噬菌体颗粒，将5 mL无菌的含0.4%细菌学琼脂的LB培养基（上层琼脂）接种 100 µL 对数中期指示菌（OD600：0.4–0.5；此处为 PAO1-RifR）^R在适当的筛选剂存在下50 µg·mL⁻¹ 利福平，在此情况下，因为PAO1宿主的MIC仅为 16 µg·mL⁻¹)
1. 点样 10 µL 相同系列稀释液（见步骤1.2.2）点样至已接种的上层琼脂层，待其干燥后，于37 °C培养 37 °C 18–24 小时。
2. 为计算感染性噬菌体颗粒数量，选择噬菌斑数目易于计数的稀释度，统计每个点的噬菌斑数量。
3. 确定自发诱导每菌落形成单位（CFU）最低的时间/条件，用于后续实验步骤。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号
PAO1		6
LESB58		6
LES噬菌体	使用诺氟沙星从LESB58中诱导并纯化。
溶原性肉汤（LB）	Merck	1.10285.500
LB琼脂	Merck	1.10283.500
琼脂粉	Fisher	A/1080/53
顶层琼脂	每100 mL水中加入0.4 g琼脂粉和2.5 g LB肉汤；高压灭菌后使用。	-
利福平	Sigma（储备液：50 mg/mL，溶于甲醇；充分混匀后用0.22 µm滤膜过滤除菌，-20°C保存备用）	R3501

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