诱导前噬菌体裂解复制以进行转录组分析

摘要

来源：Krishnamurthi, R., 等. 通过转录组学研究温和型细菌噬菌体对其溶原菌的影响。J. Vis. Exp. (2024)

本视频展示了如何诱导整合于细菌基因组中的前噬菌体进入裂解复制，并通过时间序列取样捕获基因表达变化，以进行转录组分析。

方案

1 . 用于RNA（核糖核酸）提取的未诱导和诱导溶原菌培养物的制备

1. 通过将溶原性菌的单菌落接种于5 mL LB培养基中，制备新鲜的过夜培养物，并在37 °C、180 rpm振荡条件下培养18–24 h。 37 °C 振荡培养（180 rpm，转/分钟），18–24 小时。
2. 将过夜培养物按1:100的比例接种于八个250 mL锥形瓶中的80 mL LB（Lysogeny broth）培养基中进行传代培养。
3. 将第一个烧瓶标记为“未诱导”，其余烧瓶标记为“诱导”，并注明各样品应收获的时间点（即“诱导 t = 0”、“诱导 t = 10 min”、“诱导 t = 20 min”等；图1).
4. 孵育90分钟后，当OD（光密度）600在0.1–0.2之间，或处于自发诱导最低时间点时（见讨论部分），加入 4 µL 向未诱导的烧瓶中加入体积分数为1%的冰醋酸（v/v）（图1).
   注意： 由于本研究中所用的诱导剂以1%冰醋酸作为溶剂，因此单独加入等量溶剂作为对照步骤。根据不同的诱导剂制备方法，可考虑采用其他对照方式。
5. 将未诱导烧瓶中的80 mL培养物加入720 mL无菌LB培养基中，并立即加入终体积为培养物体积20%（160 mL）的终止液（冰浴预冷的5% [v/v] 苯酚，pH 4.3，95% [v/v] 乙醇），置于冰上孵育至少30分钟，但不超过2小时，以稳定RNA转录本。此即为未诱导样品。
6. 在七个250 mL锥形瓶中对剩余的培养物进行诱导（图1) 使用适当诱导剂的 FMIC（最终最小抑菌浓度）（此处为 25 mg·mL−1 诺氟沙星，用1%冰醋酸（w/v）配制，终浓度为 1 µg·毫升⁻¹），充分混匀，并在 37 °C 并在180 rpm条件下振荡培养1小时。
   注意： 此步骤将促使溶原菌培养物进入更为协调的裂解复制状态。培养物中的大多数细胞将开始进行感染性噬菌体颗粒的裂解产生。
7. 通过将诱导后的烧瓶中的80 mL培养物加入720 mL无菌LB培养基中，使细胞恢复，从而有效稀释诱导剂。从0时起，每隔10分钟向各烧瓶中加入终止液（如步骤1.5所述），收集细菌细胞，持续至1小时。
   注意： 终止液可使RNA稳定长达2小时。然而，为提高样品稳定性，后续所有步骤均应在4 °C下进行 4 °C.
8. 在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 15 分钟收集菌体 4 °C 尽快进行，不得超过处理后2小时，以避免RNA降解。
9. 弃去上清液，用可调自动移液器将细菌沉淀在残留液体中轻轻重悬，然后将每个样品转移至1.5 mL微量离心管中。
10. 在微量离心机中以高速（13,000 × g）于 4 °C 离心微量离心管 1 分钟，弃去残留上清液。 4 °C 1分钟，弃去残留上清液。
11. 将每个密封的微量离心管浸入液氮中进行速冻。这有助于在RNA提取过程中高效裂解细胞。
12. 向每个冷冻沉淀中加入TRIzol（1 mL），通过移液吹打使悬浮液均质化（禁止涡旋振荡）。置于−80 °C保存，直至准备对所有样品进行RNA提取。80 °C 直到准备对所有样品进行RNA提取时为止。
    注意： 此步骤可暂停。
13. 使用三个生物学重复重复步骤 1.1–1.13。

结果

图1：用于RNA提取的诱导与非诱导培养物取样实验设计。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LES噬菌体	使用诺氟沙星从LESB58诱导并纯化。	本研究
溶原性肉汤（LB）	Merck	1.10285.500
溶原性肉汤（LB）琼脂	Merck	1.10283.500
琼脂 琼脂	Fisher	A/1080/53
顶层琼脂	0.4 g 琼脂粉 + 2.5 g LB 肉汤溶于 100 mL 水中；高压灭菌后使用。	-
利福平	Sigma（储备液：50 mg/mL，溶于甲醇——充分混匀后使用） 0.22µm 过滤除菌并储存于 -20°C 直至使用	R3501
冰醋酸	Fisher 1%（v/v）水溶液	10060000
诺氟沙星	Sigma（储备液：25 mg/mL 溶于 1% 冰醋酸中）—充分混匀后使用 0.22µm 过滤除菌并储存于 -20°C 直至使用；为避免冻融循环，应分装成小份保存	N9890
柠檬酸盐缓冲液饱和的苯酚，pH 4.3	Sigma	P-4682
分子生物学级乙醇	Fisher	16695992
TRIzol	Invitrogen	12044977
氯仿	Fisher	11398187
异丙醇	Fisher	17150576
无核酸酶水	Invitrogen	10526945