已建立一种在受精后24小时（24hpf）将吗啉代寡核苷酸直接递送至斑马鱼耳囊的方法。通过将吗啉代寡核苷酸微量注射至听泡腔内，并结合电穿孔促进其穿透，我们能够避免吗啉代寡核苷酸对脑部的影响，从而获得特异性作用于内耳的效果。
本文内容
摘要
摘要
近年来，电穿孔已成为一种流行的技术，可用于将 DNA、RNA 和吗啉代寡核苷酸（morpholinos）体内转染到多种组织中，包括斑马鱼的眼、脑和体节。与其他基因操作方法相比，电穿孔的优势在于可通过施加电流，实现对特定组织在空间和时间上的靶向大分子导入。本文描述了利用电穿孔技术将 mif 和 mif-like 吗啉代寡核苷酸转染至斑马鱼发育内耳组织的方法。以往研究表明，在 1 至 8 细胞期将 mif 吗啉代寡核苷酸注射到胚胎中，会导致神经系统、眼睛以及耳部出现广泛的形态学改变。通过在发育后期靶向内耳组织，我们能够区分 MIF 在内耳发育中的直接作用，而非由其他组织影响所致的间接效应。我们利用鬼笔环肽（phalloidin）和乙酰化微管蛋白染色来研究与后耳斑相关的神经元、神经突起和毛细胞的形态，从而评估电穿孔作为斑马鱼内耳靶向转染方法的有效性。我们对 24 小时受精后（24hpf）胚胎的耳泡注射吗啉代寡核苷酸并进行电穿孔处理，并与未接受任何处理、仅注射或仅电穿孔的胚胎进行比较。结果显示，经注射并电穿孔的胚胎相较于对照组，毛细胞数量减少，前庭耳蜗神经节（SAG）的神经支配减弱，且 SAG 神经元数量更少。我们的结果表明，在发育后期直接将吗啉代寡核苷酸递送至耳囊，可避免在 1–8 细胞期递送时对神经系统和神经嵴产生的非特异性影响；同时也使得研究人员能够特异性地研究内耳的直接效应，而非由脑、神经嵴或耳周间充质的初级效应所引发的继发性耳部影响。
方案
1. 制备电穿孔电极
- 剪取适当长度（约 3-5 cm）的 75 μm 直径钨丝（A-M Systems, Inc. Carlsborg, WA）
- 将钨丝穿过 Molex 电缆连接器（引脚为冲压黄铜材质）
- 用热缩管（SPC Technology, Chicago, IL）包裹钨丝与 Molex 电缆连接器，并使用本生灯或热风枪加热，使热缩管紧固在导线上
- 为 sharpen 钨丝尖端，将钨丝浸入 1.0 N 氢氧化钠溶液（Conrad et al. 1993），以回形针作为另一电极，使用方波电穿孔仪进行电解。我们采用的条件为：5 次 50 伏脉冲，每次持续 100 ms，脉冲间间隔 50 ms。电极尖端应 sharpen 至直径 15–20 μm
- 在用于电穿孔前，将钨丝存放于模型黏土压出凹槽的托盘中保存
2. 设置电穿孔工作站
- 将打磨好的 75μm 钨电极固定在显微操作器上（World Precision Instruments）。
- 将显微操作器置于解剖显微镜载物台（Leica）两侧。
- 将电极连接至 Protect CUY-21 Edit 方波电穿孔仪（图 1）。
- 打开电穿孔仪，设置电穿孔参数，包括电压、脉冲持续时间和脉冲次数。本实验中最有效的参数为：3 次 13 伏特脉冲，每次持续 5.0 毫秒，脉冲间隔 100 毫秒。若电穿孔在胚胎中产生气泡，应缩短脉冲时长。
3. 向斑马鱼耳囊显微注射吗啉代寡核苷酸
- 从繁殖缸中收集斑马鱼胚胎。将胚胎置于含有0.3 PPM亚甲蓝的胚胎培养液中，在28.5°C条件下过夜孵育（Westerfield, 2005）。
- 使用Sutter P-97电极拉制仪拉制玻璃针。
- 将琼脂糖凝胶基质（含1%琼脂糖的鱼用水，置于10 mm培养皿中）在水浴中加热至37°C。
- 将1%低熔点琼脂糖（LMPA）在鱼用水中加热至完全融化，并保持在37°C水浴中保温。
- 用吗啉寡核苷酸溶液（GeneTools, Corvallis, OR）填充玻璃针，剪切针尖至合适直径。将注射针安装到显微操作器（Kuhn）上。
- 将针尖剪切至约10 μm，并插入矿物油中测试，确保针尖可充分输送吗啉寡核苷酸溶液。
- 在受精后24小时（hpf）去除胚胎的绒毛膜，并用含0.3 PPM亚甲蓝的鱼用水中的MS222（三卡因，Sigma）麻醉胚胎。
- 将3至5个麻醉后的胚胎整齐排列在琼脂糖凝胶基质上，保持胚胎右侧朝上，以便进行一致且方便的观察分析。
- 在每个胚胎上方滴加1至2滴1% LMPA，待其凝固以固定胚胎位置。
- 旋转培养皿，使耳囊位于右侧。
- 将注射针插入耳囊腔内，使用连接氮气罐的PV820气动皮升注射泵（World Precision Instruments）注入吗啉寡核苷酸溶液（图2）。
4. 电穿孔实验步骤
- 注射后立即将固定好的胚胎转移至电穿孔工作站
- 将正极电极放置在耳泡后方的组织上，但不要刺入；将负极电极插入耳泡前方的脑组织中
- 通过脚踏开关或手动按压开关施加电流
- 将鱼用水倒入琼脂糖中，用旋转动作和玻璃移液管将胚胎从琼脂糖中取出。注意避免损伤胚胎。对于难以取出的胚胎，可用针头轻轻去除胚胎周围的所有低熔点琼脂糖（LMPA）
- 将胚胎置于含亚甲蓝鱼用水的培养皿中，并培养至所需发育阶段以进行分析（形态学、免疫组织化学、原位杂交等以及显微观察）
5. 代表性结果：
图1. 电穿孔装置。电极由磨尖的75μm钨丝制成，并通过导线连接至Protect CUY-21 Edit方波电穿孔仪。这些电极被固定在显微操作器上。
图 2. 注射工作站。为标准化起见，所有胚胎均注射于右耳。
图 3. 用鬼笔环肽对3天龄胚胎中的肌动蛋白丝进行染色。(A) 注射对照吗啉代（MO）的3天龄胚胎在后部斑（pm）显示出强烈的鬼笔环肽染色信号。(B) 注射对照MO后进行电穿孔的胚胎，其后部斑中的鬼笔环肽染色水平与仅注射的胚胎相似。(C) 单独向耳囊注射mif吗啉代并未引起鬼笔环肽染色的减少，而同时注射mif吗啉代并进行电穿孔则导致后部斑中鬼笔环肽染色显著减弱（D）。am，前部斑。
图 4. 使用 5 dpf 幼鱼进行肌动蛋白丝的鬼笔环肽染色。当使用标准对照吗啉代时，仅注射（A）与注射联合电穿孔（B）之间无明显差异。然而，与仅注射 mif 吗啉代的胚胎（C）相比，注射 mif 吗啉代并进行电穿孔的 5 dpf 幼鱼在后部耳石（pm）区域显示出鬼笔环肽染色减弱（D），尽管其程度较 3 dpf 时轻微。am，前部耳石。
图 5. 3 dpf 胚胎的乙酰化微管蛋白染色。图 (A) 中的胚胎未接受任何注射或电穿孔处理。图 (B) 中的胚胎接受了电穿孔但未进行注射。同时接受注射和电穿孔处理的胚胎（C, D）使用 mif 形态素后，微管蛋白染色明显弱于对照组。（pm，后部斑块）。
图6. 注射对照吗啉代的3天龄胚胎中乙酰化微管蛋白染色结果。（A）未经任何处理的胚胎，其后部斑块区（pm）显示出强烈的乙酰化微管蛋白染色信号，并伴有广泛的神经支配。（B）注射对照吗啉代的胚胎。（C）仅接受电穿孔处理的胚胎。（D）注射对照吗啉代并进行电穿孔的对照胚胎，其后部斑块区的乙酰化微管蛋白信号强度和神经支配程度与未经处理的对照组相似。
讨论
我们已成功将反义寡核苷酸MO注入24小时受精龄斑马鱼胚胎的耳部。注射并进行电穿孔后继续培养的胚胎具有活力。若胚胎在电穿孔过程中存活，则其生长速率与未经处理的胚胎、仅注射的胚胎以及仅进行电穿孔的胚胎相比均正常。
通过鬼笔环肽和乙酰化微管蛋白标记，我们观察了耳部注射并电穿孔 mif 和 mif-like 吗啉代寡核苷酸（MOs）后产生的效应。对后部椭圆囊感觉毛细胞中肌动蛋白丝进行鬼笔环肽染色显示，在24 hpf阶段对 mif 和 mif-like MO 进行电穿孔会导致毛细胞和/或静纤毛数量发生变化，而仅注射MO的胚胎则无此变化（图3）。毛细胞数量的减少与Shen et al.（已投稿）的研究结果一致，即针对 mif 和 mif-like 的MO会导致球囊斑中毛细胞数量减少。在注射MO并进行电穿孔的胚胎中观察到毛细胞数量减少，表明电穿孔可能有助于MO穿过细胞膜，从而相较于仅向听泡注射的胚胎，增强了形态学效应。通过乙酰化微管蛋白染色观察到前庭耳蜗神经节形态的变化。神经支配范围受到影响，表现为经注射并电穿孔的胚胎中神经突分支减少（图5）。此外，可能存在神经节细胞凝聚程度降低和/或神经节细胞数量减少，因为在同时接受注射和电穿孔的胚胎中，乙酰化微管蛋白染色信号显著减弱。由于已有研究表明 mif 对神经系统发育至关重要（Suzuki et al., 2004），电穿孔后观察到的变化可能是由于 mif 和 mif-like MO 溶液在神经母细胞中的转染效率提高所致。
将反义寡核苷酸吗啉代（morpholinos）直接电穿孔导入正在发育的组织中，是控制胚胎发育过程中特定组织时空基因表达的有效工具。将mif和mif-like吗啉代（MOs）电穿孔导入内耳组织后，导致后耳石器和前庭耳蜗神经节出现异常形态。与未经处理、仅注射或仅电穿孔的胚胎相比，经注射并电穿孔的胚胎其后耳石器中的感觉毛细胞数量减少。此外，前庭耳蜗神经节对后部感觉斑的神经支配程度以及前庭耳蜗神经节（SAG）的体积也有所下降。电穿孔是一种将大分子转染至特定组织的有价值方法，其优势在于可观察特定DNA、RNA或吗啉代（MO）在目标组织中的直接效应，并将其与对其他组织（包括脑、神经嵴和耳周间充质）产生的继发性影响区分开来（Barald 和 Kelley，2004）。
披露
本文的制作由Gene Tools, LLC赞助，该公司生产视频和文本中提到的试剂。
致谢
本工作获得了聋病研究基金会向 Y-c S 提供的资助以及美国国家科学基金会（NSF，项目号 IOS 0930096）向 KFB 提供的资助。
KFB：美国国立卫生研究院/国家耳聋与其他沟通障碍研究所（NIH/NINDCD）2 RO1 DC04184，3R01DC004184-08W1，NSF DBI 0832862，NSF IOS 0930096
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| Sutter P-97 电极拉制仪 | 设备 | |||
| PV820 气动PicoPump | 设备 | World Precision Instruments, Inc. | ||
| M3301L 手动显微操作器 | 设备 | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Leica S6D 体视显微镜 | 设备 | |||
| 保护 CUY-21 Edit 方波电穿孔仪 | 设备 | |||
| 奥林巴斯FV500共聚焦显微镜 | 设备 | |||
| 0.01 英寸铂金丝 | 供应 | A-M Systems | 711000 | |
| 热缩管 | 供应 | 纽瓦克公司 | 03F3172 | |
| 插口压接端子 | 供应 | Digi-Key | 82PECT-ND | |
| 毛细血管 | 供应 | Stoelting 公司 | 50613 | |
| 油泥 | 供应 | |||
| 塑料 100 mm 培养皿 | 供应 | Falcon BD | ||
| 6孔塑料培养板 | 供应 | Falcon BD | ||
|
参考文献
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).
- Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development. J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).
- Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. From placode to polarization: new tunes in inner ear development. Development. 131, 4119-4135 (2004).
重印与许可
标签
