从转染的哺乳动物细胞中收获腺相关病毒

摘要

来源：Rghei, A. D.，等．用于大型动物模型临床前研究的细胞叠层生产腺相关病毒载体．J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了利用化学裂解和离心法从转染的哺乳动物细胞中回收粗制腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）的操作流程，可为后续纯化及临床前基因治疗应用提供高产量的 AAV。

方案

1. 收获腺相关病毒（AAV）及转染的HEK293（人胚胎肾293）细胞的化学裂解

1. 剧烈震荡细胞培养容器，使细胞脱落，直至培养基因悬浮的细胞而变得浑浊，然后将悬液倒入四个500 mL离心管中。
2. 在4 °C条件下以18,000 × g离心30分钟，使细胞沉淀。将澄清的上清液倒入1 L聚对苯二甲酸乙二醇酯共聚酯（PETG）瓶中。注意：若无高速离心机，可在4 °C下以12,000 × g离心40分钟。在此转速下，细胞沉淀可能不够紧密，在倾倒上清液时沉淀会滑动。
3. 用50 mL裂解缓冲液重悬500 mL离心管中的细胞沉淀，并在37 °C下孵育60分钟。
4. 在18,000 × g离心30分钟，然后将上清液转移至同一个1 L PETG瓶中。弃去沉淀的细胞碎片。注意：应立即纯化澄清的上清液，并在4 °C下保存不超过72小时。如需长期保存，请置于-80 °C。切勿在-20 °C下保存。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 层细胞培养栈	Corning	3271
1 L PETG 瓶	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
含 1000 mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
胎牛血清（FBS）	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
HEK293 细胞	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	收到后，按生产商说明书进行细胞复苏与培养。待细胞传代次数尽可能少且生长状态良好时，将其分装冻存于液氮中以备后续使用。始终使用传代次数低于 30 的细胞。当培养细胞传代超过 30 次后，建议从冻存的分装细胞重新开始培养
大容量离心管支撑垫	Corning	CLS431124	使用大容量离心管时必须配备支撑垫，除非离心机转子已配有适配的 V 型底垫
大容量离心管	Corning	CLS431123-6EA	500 mL 离心管