来源：Rghei, A. D., et al. 大型动物模型临床前研究中利用细胞堆栈生产腺相关病毒载体。J. Vis. Exp. (2021)
该视频展示了利用基于肝素的亲和介质，从粗制宿主裂解液中纯化重组腺相关病毒（AAV）载体的方法。病毒颗粒可结合至固定化的肝素上，而杂质则被洗脱去除。通过高盐缓冲液将完整的病毒释放，并收集于富集的组分中。这些组分通过膜过滤离心进行浓缩，并经冲洗以回收残留的病毒颗粒，最终获得高纯度、高滴度的AAV载体。
方法文章
基于亲和层析的腺相关病毒载体纯化
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2026年8月31日
本文内容
摘要
方案
1. 在细胞叠中对 HEK293 细胞进行双质粒转染
- 在设定为 bead bath 的条件下解冻一管人胚胎肾 293（HEK293）细胞 37 °C.
注意： 预热完全配制的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）至 37 °C 同时缓慢解冻细胞，以防止铺板过程中发生冷休克。确保细胞代数较低，理想情况下低于20代，以保证最佳的生长状态和转染效率。确保细胞经认证无支原体污染。 - 将冻存管中的内容物逐滴转移至含有10 mL预热完全DMEM的15 mL锥形管中，并在500 ×g下离心细胞 × 5 分钟，g 力离心。
- 吸弃培养基，然后将 HEK293 细胞重悬于 20 mL 预热的完全 DMEM 培养基中。将细胞接种至 15 cm 培养皿中，并于 37 °C，含5% CO₂2.
- 将一个15 cm培养皿中的细胞分种到三个细胞培养腔中。
- 当细胞融合度达到80%时，吸除培养基，并用3 mL磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤培养板，避免破坏单层细胞。随后吸除PBS，加入3 mL胰蛋白酶。
- 孵育 2 分钟 37 °C 直至细胞从培养板上脱落，然后加入7 mL完全DMEM培养基以中和胰蛋白酶。
- 将所有培养基和细胞收集至15 mL离心管中，于500 × g离心，沉淀细胞 × 5 分钟，g 力离心。
- 吸弃15 mL离心管中的上清液，将细胞沉淀重悬于3 mL完全DMEM培养基中。取1 mL加入每个含有20 mL完全DMEM培养基的15 cm培养皿中；轻轻摇动培养皿使细胞均匀分布，随后置于 37 °C，含5% CO₂2.
- 当细胞融合度达到80%时，重复步骤1.4.1和1.4.2。将上清液收集至50 mL锥形管中，并轻轻倒置管子以确保细胞均匀悬浮。
- 通过混合测定细胞密度 10 µL 细胞样品的 10 µL 台盼蓝染色液，并将混合液加入细胞计数板，在细胞计数仪中进行分析。
- 将1 L预热的完全DMEM培养基与所需细胞悬液混合，用于接种细胞培养室（表面积为6360 cm²）2) 与 1 × 104 细胞/平方厘米2将细胞混合液倒入细胞培养室，轻轻旋转以使细胞均匀分布在每个单层上（图1）并在指定条件下孵育 37 °C，含5% CO₂2.
- 除了细胞培养腔室外，还需用1 × 104 细胞/平方厘米2 作为汇合度的参考。
- 孵育约65小时后，检查参照培养板的汇合度，理想情况下应达到约80%–90%汇合。
注意： 将完全DMEM预热后加入细胞培养室 37 °C. - 以3:1（w/w）的质量比配制聚乙烯亚胺（PEI）/DNA混合物。
- 在50 mL锥形管中加入DNA混合物进行配制 475 µg pTrangene 和 1425 µg 将pHelper加入40 mL低血清培养基中，以形成pHelper与pTransgene 3:1的比例。
注意： PEI/DNA混合物计算器可通过以下方式找到 表1.
- 在50 mL锥形管中加入DNA混合物进行配制 475 µg pTrangene 和 1425 µg 将pHelper加入40 mL低血清培养基中，以形成pHelper与pTransgene 3:1的比例。
| 细胞培养室的转染 | |||||
| 方案 | |||||
| 1. 转染前将DNA、OptiMEM和PEI恢复至室温 | |||||
| 2. 输入需要转染的细胞堆叠数量（无需额外量） | |||||
| 3. 确保目的基因质粒和辅助质粒的浓度准确，因为这会影响所需体积 | |||||
| 细胞培养室数量 | 1 | ||||
| 目的基因质粒浓度 | 1 | mg/mL | |||
| pDGM6.2FF质粒浓度 | 1 | mg/mL | |||
| 每细胞培养室用量 | 转染主混合液 | ||||
| OptiMEM | 48.1 | mL | 48.1 | mL | |
| 目的基因质粒与辅助质粒1:3比例 | pTransgene | 475 | µg | 475 | µL |
| pHelper | 1425 | µg | 1425 | µL | |
| 4. 将所需体积的OptiMEM和质粒DNA加入一个50 mL锥形管中 | |||||
| 5. 颠倒混合10次 | |||||
| PEI与DNA 3:1比例 | PEI Max | 5.7 | mL | 5.7 | mL |
| 6. 将所需量的PEI加入含有OptiMEM和质粒DNA的50 mL管中 | |||||
| 7. 立即盖紧50 mL管，涡旋并颠倒混合3–5次 | |||||
| 8. 设置计时器孵育10分钟，使PEI复合物形成 | |||||
| 9. 将待转染的细胞堆叠转移至生物安全柜（BSC）中 | |||||
| 10. 10分钟后，将转染混合液倒入一个橙色端口 | |||||
| 11. 轻柔混匀液体，使其流经整个细胞堆叠 | |||||
| 12. 将转染后的细胞堆叠放回培养箱，确保每层液体体积相等 | |||||
| 13. 72小时后收获细胞培养室 | |||||
表1：细胞培养室转染计算器。用于确定细胞培养室转染所需pTransgene、pHelper和PEI正确浓度的交互式工作表。
2. 将5.7 mL PEI（1 g/L）加入减血清培养基和DNA混合物中，逐滴添加。然后短暂涡旋，于室温孵育10分钟。
注意： PEI/DNA在室温孵育过程中会略微变浑浊。
- PEI/DNA 混合物孵育 8 分钟后，从细胞培养室中移除培养基。
注意：确保松开两个橙色盖帽，以保持培养基流畅流动，避免细胞脱落。 - 将 PEI/DNA 加入 1 L 预热的完全 DMEM 培养基中，缓慢将混合液倒入细胞培养室的加样口。使液体均匀分布至所有排（图 1），于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 72 小时。
2 收获腺相关病毒（AAV）及转染的 HEK293 细胞的化学裂解
- 剧烈振荡细胞培养室，使细胞脱落，直至培养基因脱落的细胞而呈现浑浊，然后倒入四个500 mL离心管中。
- 在4 °C条件下，以18,000 × g离心30分钟，使细胞沉淀。将澄清的上清液倒入1 L聚对苯二甲酸乙二醇酯共聚物（PETG）瓶中。
注意：若无高速离心机，可在4 °C下以12,000 × g离心40分钟。此转速下细胞沉淀可能不够紧密，倾倒上清液时沉淀会滑动。 - 用50 mL裂解缓冲液重悬各500 mL离心管中的细胞沉淀，并在37 °C孵育60分钟。
- 以18,000 × g离心30分钟，然后将上清液转移至同一1 L PETG瓶中。弃去沉淀的细胞碎片。
注意：应立即纯化澄清的上清液，可在4 °C保存最多72小时。如需长期保存，应置于-80 °C。切勿在-20 °C保存。
使用肝素亲和层析纯化3型腺相关病毒载体
- 将粗裂解液从 -80 °C 取出，在 4 °C 下过夜解冻。解冻后，使用 0.22 µM 滤器过滤粗裂解液。
- 为钝化离心浓缩装置，针对每个正在使用的肝素琼脂糖柱，在离心浓缩装置中加入 4 mL 滤器预处理缓冲液。在室温下钝化离心浓缩装置 2–8 小时。应在纯化步骤开始前立即进行钝化处理。
- 安装管路和泵（图 2）。
- 将管路放入蠕动泵中，泵入 20 mL 1 M NaOH。随后泵入 50 mL 分子生物学级水，再泵入 50 mL 基础 DMEM。
- 将 5 mL 肝素琼脂糖柱连接至管路，并泵入 25 mL 基础 DMEM 以去除防腐剂。
- 以 1–2 滴/秒的流速，将过滤后的粗裂解液以 0.2 µM 流经层析柱。
注意：操作过程中切勿引入气泡或使柱子流干，否则将破坏柱子并影响腺相关病毒（AAV）的洗脱。若柱子流干，应弃用该柱，并对剩余的粗裂解液使用新的柱子。
- 将全部粗裂解液上样至肝素柱，并使用以下溶液洗涤柱子。
- 使用 50 mL 的 1 进行洗涤× 不含镁的汉克平衡盐溶液（HBSS）2+ 和 Ca2+.
- 用不含 Mg 的 HBSS 配制的 0.5 % N-月桂酰肌氨酸钠溶液 15 mL 洗涤2+ 和 Ca2+.
- 使用不含 Mg 的 50 mL HBSS 洗涤2+ 和 Ca2+.
- 使用含 Mg 的 HBSS 洗涤，体积为 50 mL2+ 和 Ca2+
- 使用 50 mL 含 Mg 的 200 mM NaCl/HBSS 溶液洗涤2+ 和 Ca2+.
- 洗脱 5 × 5 mL（共25 mL），含300 mM NaCl的HBSS（含Mg）2+ 和 Ca2+ 并将洗脱液标记为 E1–E5（每次洗脱体积为 5 mL）。
- 使用离心浓缩器浓缩病毒
- 将含有预处理缓冲液的离心浓缩器以900 × g离心 × g 离心 2 分钟。弃去穿流液。
- 用 4 mL 含 Mg 的 HBSS 冲洗离心浓缩滤器2+ 和 Ca2+ 并以1000离心 × g 离心 2 分钟；弃去穿流液。
- 将洗脱液 E2 加入离心浓缩器中，在 1000 × g 条件下离心 × g 离心 5 分钟，弃去穿流液。
- 加完E2后，再加入E3至离心浓缩管中，于1000 × g下离心 × g 离心 5 分钟，直至浓缩病毒体积约为 1 mL。
注意： 避免离心至载体体积低于滤膜水平。不要在离心浓缩装置中浓缩 E1、E4 或 E5，因为这些组分中载体含量极少或不含载体，且含有污染物。 - 使用 p200 滤芯吸头从离心浓缩装置中取出浓缩的病毒，并转移至无菌的 1.5 mL 离心管中。
- 用缓冲液冲洗离心浓缩器 200 µL 含Mg的HBSS2+ 和 Ca2+ 用力吹打多次（约30秒），以从滤膜上解离任何残留的AAV，将液体转移至含有其余病毒的1.5 mL离心管中。充分混匀该管。
- 分装 5 µL 用于DNA提取，并将纯化的载体储存于 -80 °C.
- 用25 mL 2 M NaCl洗涤层析柱。随后使用预热至指定温度的25 mL 0.1% Triton X-100进行洗涤。 37 °C 用于洗涤柱子。接下来，使用50 mL无菌去离子水洗涤柱子2O，然后用25 mL的20%乙醇洗涤。
- 确保柱膜完全浸没于20%乙醇中，因为这是保存溶液。用所提供的塞子密封柱体，并于 4 °C.
- 将管路储存于 1 M NaOH 中。
注意： 若清洗得当，肝素琼脂糖柱可重复使用多达五次。
结果
图1：细胞堆栈在细胞接种和转染过程中的操作。 进行细胞接种时，首先取下其中一个通气盖，加入1 L预热的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），并加入所需数量的HEK293细胞（A）。通过拧紧两个通气盖，轻轻晃动使细胞和培养基均匀分布，并将所有培养基移至细胞堆栈的一个角落，将通气盖置于该角落（B），然后将细胞堆栈侧放（C），再将细胞堆栈旋转90°（D），使通气口朝上（E）。轻柔地将细胞堆栈放回正常的水平位置，并确保细胞堆栈的所有腔室均被培养基完全覆盖（F）。进行转染时，拧开两个通气盖，缓慢将旧培养基倒入无菌废液容器中，保持平稳流动，避免扰动细胞单层（G）。
图2：用于腺相关病毒（AAV）纯化的蠕动泵装置设置。 将管路从粗裂解液引出，穿过蠕动泵，然后接入肝素亲和层析柱。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm 滤器 | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
| 0.25% 胰蛋白酶 | Fisher Scientific | SM2001C | |
| 10 层细胞工厂 | Corning | 3271 | |
| 1 L PETG 瓶 | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
| 细胞培养皿 | Greiner bio-one | 7000232 | 15 cm 培养皿 |
| 培养锥形管 | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 15 mL 锥形管 |
| 培养锥形管 | Fisher Scientific | 14955240 | 50 mL 锥形管 |
| 含 D-葡萄糖（1000 mg/L）和 L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| 乙醇 | Greenfield | P016EA95 | 将乙醇（95% 体积分数）稀释至 20%，用于第 3.7.4 节 |
| 胎牛血清（FBS） | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
| 含 Mg²⁺ 和 Ca²⁺ 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS） | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
| 不含 Mg²⁺ 和 Ca²⁺ 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS） | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
| HEK293 细胞 | American Tissue Culture Collection | CRL-1573 | 收到后，将细胞解冻并按照生产商说明书进行培养。待细胞传代次数较少且生长状态良好时，分装部分细胞冻存于液氮中以备后续使用。始终使用传代次数低于 30 的细胞。一旦培养细胞传代超过 30 次，建议从冻存的细胞分装中重新开始培养 |
| 硫酸肝素柱 | Cytiva Life Sciences | 17040703 | |
| 大体积离心管支撑垫 | Corning | CLS431124 | 使用大体积离心管时必须配备支撑垫，除非离心机转子本身带有合适的 V 型底垫 |
| 大体积离心管 | Corning | CLS431123-6EA | 500 mL 离心管 |
| 微量离心管 | Fisher Scientific | 05-408-129 | 1.5 mL 微量离心管，使用前灭菌 |
| 分子生物学级水 | Cytiva Life Sciences | SH30538.03 | |
| 月桂酰肌氨酸钠盐 | Sigma Aldrich | L5125 | 注意：佩戴手套操作 |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP35810 | |
| OptiMEM 低血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| 巴斯德吸管 | Fisher Scientific | 13-678-20D | 使用前灭菌 |
| 磷酸盐缓冲液（10×） | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | 稀释至 1× 后用于细胞处理 |
| 青霉素-链霉素溶液 | Cytiva Life Sciences | SV30010 | |
| pHelper 质粒 | 全新设计或从质粒库获取 | NA | |
| 吸管架 | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | 购买无菌吸管架 |
| 聚乙二醇叔辛基苯基醚（Triton X-100） | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | 注意：佩戴手套操作 |
| 聚乙烯亚胺（PEI） | Polyscience | 24765-1 | 按照生产商说明配制 1 L 溶液，经 0.22 μm 滤器过滤后于 4°C 保存 |
| pTrangene 质粒 | 全新设计或从质粒库获取 | NA | 基因组中必须包含 SV40 polyA，以确保与第 5.0 节中的 AAV 滴度测定兼容 |
| 泵用管路 | Cole-Parmer | RK-96440-14 | 优化管路长度，以提高 E1–E5 组分中病毒的回收率 |
| 氢氧化钠（NaOH） | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
| 台盼蓝 | Bio-Rad | 1450021 |
