基于慢病毒载体的大鼠受精胚胎转导

摘要

来源：Koza, P., 等。利用慢病毒载体方法生成转基因大鼠。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了通过显微注射将慢病毒载体递送至受精的大鼠胚胎中，以实现稳定转基因整合，从而制备转基因大鼠。

方案

所有涉及动物样本的操作均经适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 在透明带下对单细胞期胚胎进行慢病毒载体显微注射
   注意：用于显微注射的胚胎应为具有两个可见原核的单细胞期胚胎（图1）。
   1. 将慢病毒（LV）分装样品在室温下解冻，并在室温（RT）条件下以10,000 × g离心2分钟，以沉淀残留的细胞碎片。
   2. 显微注射装置准备
      1. 使用显微拉针仪制备玻璃持卵管（硼硅酸盐玻璃毛细管）。将玻璃毛细管在火焰上拉制，形成5–10 cm长的尖端。折断毛细管，保留约4 cm长的尖端。外径应约为80–120 µm。
         注意：确保毛细管尖端完全笔直且光滑。
      2. 将拉制好的毛细管安装到显微拉针仪上，使尖端位于加热丝前方。将加热丝紧靠毛细管尖端加热，使其收缩至直径约15 µm（约为胚胎大小的20%）。将毛细管垂直于加热丝放置，距离尖端2–3 mm，开始加热。玻璃将软化，持续加热直至形成15°角。
      3. 使用拉针仪制备带纤维的显微注射用硼硅酸盐玻璃毛细管。将毛细管插入拉针室中。运行斜坡测试（新玻璃首次使用时以及每次更换加热丝后均需进行）。将加热值设为斜坡值减10，拉力设为100，速度设为150，时间设为100。
         注意：可根据需要调整参数，以获得最佳注射毛细管。
      4. 在生物安全超净工作台内，使用微量加样器吸头将约2 µL病毒溶液装入显微注射毛细管中。
      5. 准备一个显微注射培养皿（60 mm培养皿的盖子），中央加入100 µL M2培养基液滴，并用液体石蜡或矿物油覆盖。
      6. 在倒置显微镜下，将持卵管和已装载病毒溶液的显微注射毛细管安装至显微操作仪，并置于显微注射培养皿上。
   3. 进行显微注射
      1. 将15–20个单细胞期胚胎转移至显微注射培养皿中的M2液滴内，使用持卵管固定胚胎。
      2. 在400倍放大倍数下，利用连接自动注射仪的玻璃毛细管将LV溶液注入透明带下方的卵周隙。将毛细管在透明带下方保持片刻。
         注意：通过施加轻柔的正压，病毒溶液会持续从注射毛细管中流出，但无法精确控制所递送悬浮液的体积。
      3. 使用细小的移液管将胚胎移回培养皿，置于37 °C、5% CO₂ 的培养箱中继续培养。每个受精卵的注射次数可有所不同，并可根据病毒载体浓度进行调整。
         注意：注射后的胚胎可在单细胞阶段直接移植至代孕母鼠体内，或在M16培养基中过夜孵育后于双细胞阶段再进行移植。应避免大鼠胚胎的长期体外培养。

结果

图1. 准备进行亚带区慢病毒载体注射的一细胞期大鼠胚胎的显微照片。 胚胎由固定吸管固定。可见包含母源和父源遗传物质的两个原核以及极体。比例尺 = 20 μm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于校准微量移液毛细管的吸管管组件	Sigma	A5177-5EA
带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管 GC100TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-0039	注射毛细管
CELLSTAR 组织培养皿 35 mm	Greiner Bio-One	627160
CELLSTAR 组织培养皿 60 mm	Greiner Bio-One	628160
矿物油	Sigma	M8410-500ML
倒置显微镜	Zeiss	Axiovert 200
M2 培养基	Sigma	M7167
VacuTip	Eppendorf	5175108	持胚毛细管
M16 培养基 EmbryoMax	Sigma	MR-016-D