利用亲和层析纯化病毒整合酶

摘要

来源：Lopez Jr., M. A., 等. 重组原型泡沫病毒整合酶纯化过程中核酸酶污染的检测与去除. J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了使用镍亲和层析纯化带有多聚组氨酸标签的病毒整合酶。该方案采用咪唑梯度洗脱，根据整合酶对镍离子负载树脂的亲和性选择性分离目标蛋白。

方案

1. 镍亲和层析

1. 将一管细菌沉淀置于冰上解冻。
   注意： 这将需要较长时间（约2 - 3小时）。当菌体沉淀解冻至细胞悬液状态时，加入额外的 500 μM 苯甲基磺酰氟（PMSF）（100 mM 储存液）
2. 将含有细菌悬液的50 mL离心管置于冰上。使用带有直径为0.5英寸的生物探头和直径为0.125英寸的锥形微尖端、频率为20 kHz、最大功率为400 W的超声破碎仪，对每份来源于1 L培养液的菌体沉淀进行超声处理，超声参数为30%振幅，持续30 s（工作1 s，间歇1 s）。
3. 将细胞样品转移至预冷的超速离心管中。使用与Type 60 Ti固定角转子相匹配的聚碳酸酯瓶组件（直径25 mm，高度89 mm）。若能达到相同的离心力，也可使用其他类型的离心管和转子。在4 °C条件下以120,000 × g离心60 min。 4 °C应出现明显的沉淀。上清液可能呈黄色。
4. 将上清液通过倾倒或移液转移至预冷的50 mL锥形管中。记录体积；该体积应近似于速冻前使用的重悬缓冲液体积。若上清液黏稠，可能被细菌DNA污染，进而堵塞层析柱。此时，应重复超速离心以沉淀细菌DNA。
5. 配制500 mL缓冲液A（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，500 mM NaCl， 500 μM PMSF）和500 mL缓冲液B（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，500 mM NaCl， 500 μM PMSF，200 mM 咪唑
   注意： 在本方案中，将快速蛋白液相色谱（FPLC）系统、所有缓冲液和样品置于 4 °C 在冷室中
   1. 使用0.2 μm一次性滤器对缓冲液A和缓冲液B进行无菌过滤。 0.2 μm 一次性滤器。根据快速蛋白液相色谱系统（FPLC）的不同，分别用缓冲液A和缓冲液B冲洗泵A和泵B。以90%缓冲液A和10%缓冲液B流经系统，直至电导率和紫外（UV）读数稳定。最大流速取决于仪器型号；采用5 mL/min的流速，最大压力限制为1.0 MPa。
6. 准备一根长110 mm、直径5 mm的快速蛋白液相色谱柱，装填1.5 mL镍离子螯合树脂（最大结合能力50 mg/mL，最高耐压1 MPa）。该色谱柱可在纯化前一天制备，并于4 °C保存。 ˚C.
7. 将层析柱连接至FPLC仪器。以0.5 mL/min的流速，使用20 mL含90%缓冲液A和10%缓冲液B（20 mM咪唑）的混合液平衡层析柱，最大压力限制为0.5 MPa。仪器应实时采集电导率和280 nm波长下的紫外吸光度（A280）数据。电导率和紫外读数应趋于稳定；若未稳定，需继续以缓冲液冲洗层析柱直至读数稳定。₂₈₀电导率和紫外吸收读数应趋于稳定。如果读数尚未稳定，需继续以缓冲液冲洗层析柱，直至读数稳定。
8. 以0.15 mL/min的流速和不超过0.5 MPa的压力上限将蛋白样品（每管细菌沉淀约10 mL）上样至层析柱。在整个纯化过程中，流速和柱压保持不变。用50 mL离心管收集穿流液。
   1. 用 20 mL 90% 缓冲液 A 和 10% 缓冲液 B 洗涤柱子。将洗涤液收集至 50 mL 离心管中。用 20 mL 线性梯度洗脱蛋白质，缓冲液 B 比例从 10% 升至 100%（咪唑浓度从 20 mM 升至 200 mM）。
   2. 最后，用5 mL 100% Buffer B（200 mM 咪唑）洗涤柱。将梯度洗脱液和最终洗涤液收集到每管0.27 mL的组分中。
9. 合并 15 μL 2× SDS-PAGE上样缓冲液 15 μL 流穿液、洗涤液和洗脱峰A280组分₂₈₀ 样品。将样品煮沸3分钟。
   1. 制备两块10% SDS-PAGE凝胶。上样 10 μL 每个样品10 μL上样至凝胶，并加入4 μL预染蛋白质标准品 4 μL 预染蛋白质标准品。运行电泳，染色并分析凝胶。
   2. 合并经目视检查显示含有近乎纯化的原型泡沫病毒整合酶（PFV IN）的组分。使用移液器测量体积，通常为 8 - 10 mL。
   3. 使用分光光度计测量 A₂₈₀ 合并组分并计算PFV IN蛋白的总量；典型产量约为每升诱导培养物10 mg。带有六组氨酸标签的PFV IN的消光系数为59360 cm⁻¹ M⁻¹。^-1 M^-1.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
咪唑	Sigma-Aldrich	I0250
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430