利用肝素亲和层析纯化病毒整合酶

摘要

来源：Lopez Jr., M. 等. 重组原型泡沫病毒整合酶纯化过程中核酸酶污染的检测与去除。J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了使用肝素 Sepharose 柱层析法纯化病毒整合酶以去除细菌核酸酶污染，并通过 SDS-PAGE 分析确认蛋白质纯度的实验流程。

方案

1. 肝素亲和层析
   1. 配制250 mL缓冲液C（50 mM三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl），pH 7.5，10 mM二硫苏糖醇（DTT），0.1 mM乙二胺四乙酸（EDTA），500 μM苯甲基磺酰氟（PMSF））和250 mL缓冲液D（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM DTT，0.1 mM EDTA，500 μM PMSF，1 M NaCl）。
      注意：本实验方案中，快速蛋白液相色谱（FPLC）系统、缓冲液和样品均置于4 ˚C的冷室中保存。
      1. 使用0.2 μm一次性滤器对缓冲液C和缓冲液D进行无菌过滤。根据FPLC系统的不同，分别用缓冲液C和缓冲液D冲洗泵A和泵B。以80%缓冲液C和20%缓冲液D混合液冲洗系统，直至电导率和紫外（UV）读数稳定。最大流速取决于仪器型号；我们常规使用5 mL/min的流速，最大压力限制为1.0 MPa。
   2. 准备一根长80 mm、直径5 mm的FPLC柱，装填1 mL肝素Sepharose树脂（每毫升树脂最大结合容量为2.0 mg牛抗凝血酶III；最大耐受压力1.4 MPa）。该层析柱可在纯化前一天制备，并于4 °C保存。将层析柱连接至FPLC仪器。
      1. 以0.5 mL/min的流速，用20 mL含80%缓冲液C和20%缓冲液D（含200 mM NaCl）的混合液平衡层析柱，最大压力限制为1 MPa。仪器应实时记录电导率和280 nm波长下的紫外吸光度（A₂₈₀）。电导率和UV读数应趋于稳定。若未稳定，继续用缓冲液冲洗层析柱，直至读数稳定。
   3. 通过加入1.5倍体积的缓冲液C，将原型泡沫病毒整合酶（PFV IN）样品中的NaCl浓度降低至200 mM。例如，向10 mL PFV IN样品中加入15 mL缓冲液C。总体积通常约为25 mL。
   4. 以0.5 mL/min的流速、1.0 MPa的最大压力限制，将稀释后的PFV IN样品上样至肝素Sepharose层析柱。整个纯化过程中保持流速和柱压不变。用50 mL锥形管收集穿流液。
      1. 用20 mL含80%缓冲液C和20%缓冲液D（200 mM NaCl）的混合液洗涤层析柱，洗脱液收集于50 mL锥形管中。随后用30 mL线性梯度洗脱（20%至100%缓冲液D，即NaCl浓度由200 mM升至1 M）。
      2. 用5 mL 100%缓冲液D冲洗层析柱。将梯度洗脱液和最终冲洗液按每管0.37 mL分部收集。
   5. 采用8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析上样样品、穿流液、洗涤液及各收集组分。PFV IN在切除六组氨酸标签后分子量为44,394 Da，且在无六组氨酸标签时消光系数仍为59,360 cm^-1 M^-1。所有组分于4 ˚C保存，直至完成核酸酶活性检测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）	Denville Scientific	CI8280
Tris 超纯级	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
苯甲基磺酰氟（PMSF）	Amresco	754
二硫苏糖醇（DTT）	P212121	SV-DTT
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
Heparin Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0998-01