通过噬斑实验定量假病毒颗粒

摘要

来源： Jamieson, T. R., et al., 利用高通量荧光成像检测伪病毒侵染以鉴定SARS-CoV-2中和抗体。J. Vis. Exp. (2021)

本视频介绍了使用冠状病毒假病毒颗粒进行的病毒蚀斑试验。将稀释后的假病毒加入哺乳动物细胞单层，随后用甲基纤维素覆盖层进行孵育。通过肉眼计数感染细胞形成的蚀斑，以确定感染性病毒的滴度。

方案

滴定表达冠状病毒刺突蛋白和增强型绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒（VSV-S-eGFP）假病毒

1. 系列稀释法测定病毒滴度

1. 在6孔板中接种Vero E6细胞，每孔接种密度为6 × 10⁵个细胞，培养基为含10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），于37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。

注意：过表达 TMPRSS2 和 hACE2 的 Vero 细胞也可使用。

2. 在七个微量离心管中各加入900 μL冷的无血清DMEM培养基，对VSV-SeGFP病毒进行10倍系列稀释。将试管编号为1至7。向第一管中加入100 μL病毒原液，短暂涡旋混匀。将100 μL稀释后的病毒液从第1管转移至第2管并短暂涡旋；依此类推，直至第7管。

3. 吸去含 Vero E6 细胞的 6 孔板中所有孔的培养基，每孔加入 500 μL 稀释度为 10⁵ 至 10⁷ 的病毒液。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 45 分钟，每隔 15 分钟轻轻摇动一次。

吸出接种液，加入覆盖层，覆盖层包含2倍浓度DMEM与6%羧甲基纤维素钠（CMC）的1:1混合液（最终CMC浓度为3%），并添加10%胎牛血清（FBS）；于34 °C、5% CO₂条件下孵育48小时。

注意：在感染步骤期间，将覆盖混合液在 37 °C 水浴中预热 15 分钟。可用 1% 琼脂糖与添加了 10% FBS 的 2× DMEM 按 1:1 比例配制的混合液替代 CMC。若使用琼脂糖覆盖，需将 1% 琼脂糖（溶于 dH₂O）煮沸后与冷的 2× DMEM 混合。在加至细胞单层前，确保混合液温度适宜（约 37–40 °C）。若使用琼脂糖作为覆盖物，染色前必须将细胞在 2 mL 甲醇:冰醋酸（3:1）中孵育至少 1 小时以固定细胞。

2. 染色与病毒滴度计算

1. 通过结晶紫染色或在荧光显微镜下直接观察eGFP来可视化噬斑。

2. 染色时，吸除覆盖层，用 PBS 洗涤一次，然后向每孔加入 2 mL 0.1% 结晶紫溶液（溶于 80% 甲醇和 dH₂O 中）。室温下置于摇板上约 20 分钟，再进行脱色。移除结晶紫溶液，用 dH₂O 或 PBS 轻柔地洗涤每孔两次。

注意：洗涤和染色步骤应轻柔操作，将移液枪缓慢靠近每个孔的侧壁进行加样，以确保在整个操作过程中细胞单层保持完整。

3. 在计数空斑前，让培养板干燥至少 1 小时。确保空斑计数来自含有 20 至 200 个空斑的孔。为计算病毒滴度（以每毫升空斑形成单位 (PFU) 表示），将所计孔的稀释倍数与感染体积相乘，再用该孔中空斑数量除以该乘积。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA (Gibco)	Fisher scientific	LS25200114
Vero E6 细胞	ATCC	CRL-1586
羧甲基纤维素	Sigma	C5678
杜尔贝科改良伊格尔培养基 (Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco)	Fisher scientific	10-013-CV
杜尔贝科改良伊格尔培养基（粉末）(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12-800-017
杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline, DPBS)	Fisher scientific	21-031-CV
青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific	15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) 刺突蛋白中和抗体，小鼠单克隆抗体	SinoBiological	40592-MM57