使用患者血清对表达冠状病毒刺突蛋白的假病毒进行抗体介导的中和

摘要

来源：Jamieson, T. R., 等. 利用高通量荧光成像检测假病毒感染中的SARS-CoV-2中和抗体。 J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了利用患者血清对携带冠状病毒刺突蛋白的假病毒进行抗体介导的中和作用研究，通过高通量荧光成像检测感染的上皮细胞单层来完成。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

1. 抗体或血清稀释及感染

注意：本方案可用于检测市售抗体、患者血清以及用于临床前疫苗研发研究的动物血清对表达冠状病毒刺突蛋白和增强型绿色荧光蛋白（VSV-S-eGFP）的水疱性口炎病毒假病毒的中和作用。

1. 连续稀释系列
   1. 在稀释血清样本之前，将每个样本置于56 °C水浴中加热30分钟以灭活补体。处理患者样本时应采取必要的安全防护措施；仅可在组织培养罩内打开样本容器，并确保穿戴适当的二级生物安全防护装备。
   2. 在一块空的96孔板（Plate 1）中建立稀释系列。
   3. 所有稀释均在96孔板的A行开始，总体积为80 µL。*对于患者样本，通过将8 µL血清加入72 µL无血清Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（含1%青霉素/链霉素）中，起始稀释比例为1:10。
      注意：所用中和抗体的浓度取决于制造商预测的活性。对于本实验所用的SARS-CoV-2刺突蛋白中和抗体（见材料表），建议起始浓度为5 µg/mL，以观察至少50%的中和效果。
   4. 向B至G行各孔中加入40 µL无血清DMEM（含1%青霉素/链霉素），向H行各孔中加入80 µL。H行不加病毒，作为仅含细胞的对照组。
   5. 使用12通道多通道移液器，将A行中稀释后的血清或抗体混合后转移40 µL至B行。混合后依次逐行转移至F行，从F行弃去40 µL。G行不加血清，作为仅含病毒的对照组。
2. 感染与覆盖层
   1. 准备适量稀释的VSV-S-eGFP，使每孔感染复数（MOI）为0.05（或2000个噬斑形成单位（pfu））。（进行此计算时请注意，总共80 µL体积中仅有60 µL会转移至细胞上；因此，务必将病毒体积乘以1.33，以维持2000 pfu）。
      注意：由于VSV-S-eGFP对温度敏感，使用间隙应始终保持病毒储备液置于冰上，并避免多次冻融，否则滴度会在反复冷冻后发生变化。
   2. 向Plate 1的A至G行各孔中加入40 µL稀释后的病毒，并上下吹打4–5次混匀。将板在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。
   3. 从培养箱中取出含细胞的板（Plate 2），小心吸除所有孔中的培养基。将60 µL抗体/病毒混合液从Plate 1转移至Plate 2，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时，每20分钟轻摇一次板子。
   4. 向每孔补充140 µL含有羧甲基纤维素（CMC）的覆盖层（DMEM配制），使CMC终浓度为3%（含10% FBS（胎牛血清）和1%青霉素/链霉素）。将Plate 2置于设定为34 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育约24小时，然后进行成像。
      注意：在感染步骤期间，将覆盖层混合液在37 °C水浴中预热15分钟。

2. 成像与定量（第3天）

1. 使用自动荧光成像仪对培养板进行成像（使用异硫氰酸荧光素（FITC）滤光片或激发波长为488 nm的替代滤光片）。通过创建一个可自动识别并计数单个eGFP（增强型绿色荧光蛋白）病灶的方案来定量病毒感染。如果无自动计数功能，可使用ImageJ软件对eGFP病灶数量进行定量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
羧甲基纤维素	Sigma	C5678
杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium，Gibco）	Fisher scientific	10-013-CV
杜尔贝科改良伊格尔培养基（粉末）（Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder)，Gibco）	Thermo Fisher Scientific	12-800-017
Vero E6 细胞	ATCC	CRL-1586
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline，DPBS）	Fisher scientific	21-031-CV