利用荧光报告基因监测痘苗病毒中阶段特异性基因表达

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摘要

本视频展示了一种利用受阶段特异性启动子调控的荧光报告蛋白来监测痘苗病毒复制的方法。绿色、红色和蓝色荧光蛋白的依次表达标记了感染的早期、中期和晚期阶段，从而实现对病毒基因阶段性表达的高通量分析。

方案

1. 接种细胞

从培养皿中解离HeLa细胞，并将其悬浮于生长培养基（DMEM，2 mM L-谷氨酰胺，10%胎牛血清[FBS]）中，调整细胞密度至约2.0 x 10⁵ 个细胞/ml。取100 μl/孔接种于黑色壁、透明平底的96孔板中（每孔20,000个细胞）。
将细胞在37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育24小时，直至形成汇合单层。

2. 感染细胞

稀释病毒并感染细胞。
1. 解冻 TrpV（三重病毒；早期 Venus、中期 mCherry、晚期 TagBFP）和 PLV（无启动子 Venus）荧光病毒，并使用超声处理 5 分钟以分散病毒颗粒。或者，可将粗制病毒原液与含 0.25 mg/ml 胰蛋白酶的感染培养基按 1:1 混合，在 37 °C 下孵育 30 分钟。
2. 将粗制病毒原液加入 37 °C 的感染培养基（DMEM，2 mM L-谷氨酰胺，2% 胎牛血清）中进行稀释。对于高感染复数（MOI）感染（10 PFU/细胞），假设每孔细胞数为 5 × 10⁴，接种体积为 50 μl，需将病毒原液稀释至 1.0 × 10⁷ PFU/ml。每种处理分别使用 TrpV 感染 3 个重复孔，同时使用 PLV 感染另外 3 个重复孔，以校正各处理特有的背景荧光。
3. 通过向每孔加入 50 μl 稀释后的病毒感染培养基来感染细胞。此时间点定义为感染后 0 小时（0 hpi）。
在 37 °C、含 5% CO₂ 的培养箱中孵育 6–24 小时。

3. 固定细胞

通过向每个孔中已有的感染培养基中加入 100 μl 8% 多聚甲醛来固定细胞。室温避光孵育 15 分钟。
注意：建议直接将 2 倍浓度的多聚甲醛（8%）加入感染培养基中，以防止在固定前将高滴度培养基直接倾倒至废液皿时产生感染性痘苗病毒的气溶胶。
通过将培养板倒置进入废液皿中去除固定液。
加入 100 μl 室温的磷酸盐缓冲液（PBS）。
用光学透明的压敏封板膜密封培养板。
注意：若不立即检测，培养板可在 4 °C 下保存。检测前务必让密封的培养板恢复至室温，以防止冷凝水影响分光光度计的测量结果。

材料

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