从感染昆虫个体中分离与纯化病毒

摘要

来源： Biesbrock, A. M. 等 病毒的增殖 Homalodisca coagulata 病毒-01 通过 Homalodisca vitripennis 细胞培养 J. Vis. Exp. (2014)

本视频展示了利用昆虫来源的宿主细胞进行柑橘木虱病毒-01（Homalodisca coagulata Virus-01）体外增殖的方法。概述了病毒纯化、接种以及在培养的昆虫细胞内复制的步骤。

方案

1. 全病毒提取

1. 将病毒阳性的H. vitripennis整体在磷酸盐缓冲液（pH ~7.2）中进行匀浆，缓冲液中含0.02%二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物（DETCA），通过涡旋振荡，每次约10秒，直至无明显组织大块存在。通过超速离心提取病毒：在4 °C下以124,500 × g离心4小时，或在4 °C下以22,000 × g离心16小时。若顶部出现沉淀物，用无菌棉签将其去除。
2. 弃去上清液。
3. 收集沉淀物，并用5 ml含0.4%脱氧胆酸钠和4%聚乙二醇十六醚（Brij 52）的10 mM磷酸盐缓冲液（不含DETCA），pH ~7.2，将其溶解。
   1. 为充分混匀沉淀物，必要时将管壁上的沉淀刮下并研碎，直至完全溶解。
   2. 如需进一步助溶，可每次加入约5 ml额外的10 mM磷酸盐缓冲液，并将溶液合并至2个离心管中。
4. 将溶液在300 × g下离心15分钟。
5. 移除上清液，并将溶液通过0.45 μm滤膜过滤，滤液收集至一个较大的收集管中。
6. 将滤液转移至截留分子量（MWCO）为3.5 kD的透析膜中，必要时可使用少量不含DETCA的10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7）辅助转移。
7. 将透析膜置于盛有ddH₂O的大烧杯中，于4 °C下进行透析。每小时更换一次ddH₂O，持续5–6小时，直至膜内出现白色沉淀物。
8. 从膜内收集纯化的病毒，并将100%病毒溶液进行10倍系列稀释：取10 μl溶液加入90 μl ddH₂O中，随后取10 μl稀释液再加入另一份90 μl ddH₂O中，依此操作直至获得1:100,000的稀释度。
9. 将病毒溶液于-80 °C保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Corning 细胞培养瓶	Sigma Aldrich	CLS430168	表面积 25 cm²，斜颈，带塞密封盖
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		倒置显微镜及相机
Greiner CELLSTAR 多孔培养板	Sigma Aldrich	M8937	48 孔（带盖，经组织培养处理）
DETCA	Sigma Aldrich	228680	三水合二乙基二硫代氨基甲酸钠
Corning 瓶顶式真空过滤系统	Sigma Aldrich	CLS431206	醋酸纤维素膜，孔径 0.45 μm，膜面积 54.5 cm²，过滤容量 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	聚乙二醇十六醚
磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	P5244	以无菌水将原液（100 mM）稀释至 10 mM
PBS	Sigma Aldrich	P5368	磷酸盐缓冲液
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma Aldrich	A2153
Grace 昆虫培养基（添加型，1x）	Sigma Aldrich	G8142	H2G+ 叶蝉培养基组分
L-组氨酸一水合物	Sigma Aldrich	H8125	H2G+ 叶蝉培养基组分
Medium 199（10x）	Sigma Aldrich	M4530	H2G+ 叶蝉培养基组分
Medium 1066（1x）	Sigma Aldrich	C0422	H2G+ 叶蝉培养基组分
Hank’s 平衡盐溶液（1x）	Sigma Aldrich	51322C	H2G+ 叶蝉培养基组分
L-谷氨酰胺（100x）	Sigma Aldrich	G3126	H2G+ 叶蝉培养基组分
MEM 氨基酸混合液（50x）	Sigma Aldrich	56419C	H2G+ 叶蝉培养基组分
1 M MgCl 溶液	Sigma Aldrich	M8266	H2G+ 叶蝉培养基组分
青霉素-链霉素（Pen-Strep）	Sigma Aldrich	G6784	H2G+ 叶蝉培养基组分
制霉菌素	Sigma Aldrich	N6261	H2G+ 叶蝉培养基组分
庆大霉素	Sigma Aldrich	46305	H2G+ 叶蝉培养基组分
葡萄糖	Sigma Aldrich	D9434	H2G+ 叶蝉培养基组分
胎牛血清	Sigma Aldrich	F2442	H2G+ 叶蝉培养基组分