来源：Zhang, Y., 等，小鼠成纤维细胞直接重编程为黑色素细胞。J. Vis. Exp. (2021)
本视频展示了在哺乳动物细胞中生产并浓缩重组慢病毒的方法，可高效递送转录因子或其他遗传元件，适用于细胞重编程、功能研究以及潜在的治疗研究等应用。
方法文章
在哺乳动物细胞中生成重组慢病毒
67 次观看
⸱
2026年9月30日
本文内容
摘要
方案
1. 转录因子浓缩型慢病毒包装系统的构建
- 浓缩病毒的生产Figure 1A, B)
- Plate 1.5 × 106 将 HEK (human embryonic kidney)-293T 细胞接种于 60 mm 培养皿中，并使用正常培养基培养这些细胞（参见 Table 1) 于 37 °在含5% CO₂的加湿培养箱中于37°C培养。2.
NOTE: 若需分批包装病毒，可使用 100 mm 细胞培养皿（详情参见 Table 2). - 24小时后，确保HEK-293T细胞在转导当天达到80-90%汇合度，并将培养基更换为3.5 mL DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）。’s modified eagle medium) (150 µL of DMEM per 1 cm2将细胞置于37 °在含5% CO₂的加湿培养箱中于37°C培养。2 for 2 h.
NOTE: 更换的培养基必须不含血清，以便细胞能够处于“饥饿”状态，从而获得更好的质粒转染效果。 "starved" for better plasmid transfection. - 制备质粒混合物（混合物 A），其中包含 3 µMitf、Sox10、Pax3、Sox2、Sox9 或 Snai2 的目标质粒 3 µg； µg 包装质粒 PMD2.G，以及 2 µg 包装质粒 PSPAX2。用无血清 DMEM 将混合物 A 的体积补足至 150 µL。 µ用无血清 DMEM 将混合物 A的体积补足至 150 µL。通过加入 12 µL 转染试剂（其体积为所有质粒总质量的两倍）来制备转染试剂混合物（混合物 B），并用无血清 DMEM 将混合物 B 的体积补足至 150 µL。 µ向转染试剂混合物（混合物 B）中加入 12 µL 转染试剂（其体积为所有质粒总质量的两倍），并用无血清 DMEM 将混合物 B 的体积补足至 150 µL。 µ用无血清 DMEM 将混合液 B 的体积补至 150 µL。
NOTE: 配制混合液时，需缓慢加入液体以避免产生气泡。 - 将混合液A与混合液B在室温静置5分钟后混合。将该混合物在室温孵育20-30分钟，以形成转染复合物。
- 将 HEK-293T 细胞从培养箱中取出，更换为含 2% FBS（胎牛血清）的 DMEM 培养基，逐滴加入步骤 1.1.4 中的混合物，并轻轻混匀液体。
- 8小时后，更换为3.5 mL正常培养基。更换培养基后，分别于24小时和48小时收集病毒上清液。
- 将两个不同时间点收集的病毒上清液混合。在 4°C 下以 200 × g 离心 5 分钟。 × 在 4°C 下以 200 × g 离心 5 分钟。 °C. 将上清液通过 0.45 µm 滤器过滤。 µm filters and collect it in a 50 mL sterile conical tube.
NOTE: 24 小时收集的病毒可于 4°C 保存。 °C，并与 48 小时收集的病毒混合。 - 将病毒上清液在 6000 × g、4°C 条件下离心过夜（约 16 小时）进行浓缩。 × g，4°C °在 4 °C 下以 6000 × g 离心过夜（约 16 小时）。确保离心后可在锥形管底部看到病毒沉淀。
- 缓慢倾去上清液。将病毒沉淀重悬于体积为原病毒上清液1/100的正常培养基中。th 将病毒沉淀重悬于体积为病毒上清液1/100的正常培养基中。使用P1000微量移液器，轻柔地反复吹打直至获得均匀混合物。根据需要将浓缩病毒分装至微量离心管中。储存于 −80 °C.
NOTE: 采用此方法可将病毒浓缩100倍。浓缩病毒（100x）可在-80°C条件下储存超过1年。 >1 年 −80 °C. 避免病毒反复冻融。
- Plate 1.5 × 106 将 HEK (human embryonic kidney)-293T 细胞接种于 60 mm 培养皿中，并使用正常培养基培养这些细胞（参见 Table 1) 于 37 °在含5% CO₂的加湿培养箱中于37°C培养。2.
表1：基础培养基与重编程培养基的成分。
| 成分 | 用量（浓度，体积） | 终浓度 | |
| 正常培养基（100 mL） | DMEM/HIGH GLUCOSE | 89 mL | |
| 热灭活胎牛血清（FBS） | 10 mL | ||
| 抗生素（青霉素/链霉素，Pen/Strep） | 10000 U/mL, 1 mL | 100 U/mL | |
| 重编程培养基（100 mL） | RPMI-1640 | 88 mL | |
| 热灭活胎牛血清（FBS） | 10 mL | ||
| 重组人干细胞因子（SCF） | 200 μg/mL, 50 μL | 100 ng/mL | |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | 4 μg/mL, 250 μL | 10 ng/mL | |
| 重组人胰岛素 | 10 mg/mL, 50 μL | 5 μg/mL | |
| 人内皮素-3（EDN3 human） | 100 μM, 100 μL | 0.1 μM | |
| 霍乱毒素 | 0.3 mg/mL, 0.56 μL | 20 pM | |
| 佛波醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯（TPA） | 1 mM, 20 μL | 200 nM | |
| 氢化可的松 | 100 μg/mL, 500 μL | 0.5 μg/mL | |
| 腺嘌呤 | 40 mg/mL, 60 μL | 24 μg/mL |
表2：慢病毒包装系统的详细信息。
| 培养皿 | 接种密度（细胞/皿） | 培养基（mL） | 质粒系统 | 转染试剂（µL） | ||
| 目的质粒（μg） | PMD2.G（μg） | PSPAX2（μg） | ||||
| 35 mm | 6 ×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 mm | 1.5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 mm | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
结果
图1：浓缩病毒的制备及滴度测定。 （A）用未浓缩慢病毒（1x）和浓缩慢病毒（100x）感染HEK-293T细胞后GFP（绿色荧光蛋白）的荧光强度。（B）通过流式细胞术检测未浓缩慢病毒（1x）与浓缩慢病毒（100x）的感染率比较。（C）浓缩慢病毒的滴度估算。比例尺 = 250 µm。缩写：GFP = green fluorescent protein；TU = 转导单位。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.45 μM 滤膜 | Millipore | SLHVR33RB | |
| 95%/100% 乙醇 | LANBAO | 210106 | 室温保存 |
| 抗生素（青霉素/链霉素） | Gibco | 15140-122 | –20 °C 保存 |
| 抗 TRP2/DCT 抗体 | Abcam | ab74073 | 宿主/同种型：兔 IgG；种属反应性：小鼠/人；使用稀释比例为 1:200 |
| DMEM（高糖） | HyClone | SH30243.01 | 4 °C 保存 |
| DMSO | Sigma | D2650 | 室温保存 |
| FBS | Gibco | 10270-106 | –20 °C 保存；使用前热灭活 |
| 明胶 | Sigma | G9391 | 室温保存 |
| GFP-PURO 质粒（Mitf、Sox10、Pax3、Sox2、Sox9 和 Snai2） | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | –20 °C 保存 |
| 苏木精 | Abcam | ab220365 | 室温保存 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | 转染试剂，4 °C 保存 |
| PBS (–) | Gibco | C10010500BT | 室温保存 |
| 佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯（TPA） | Sigma | P8139 | 储存浓度 1 mM；终浓度 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | 阳离子聚合物转染试剂；储存浓度 8 μg/µL；终浓度 4 ng/µL |
| 嘌呤霉素 | Gibco | A11138-03 | –20 °C 保存 |
| 重组人 bFGF | Invitrogen | 13256-029 | 储存浓度 4 μg/mL；终浓度 10 ng/mL |
| 重组人胰岛素 | Sigma | I3536 | 储存浓度 10 mg/mL；终浓度 5 µg/mL |
