在哺乳动物细胞中生成重组慢病毒

摘要

来源：Zhang, Y., 等，小鼠成纤维细胞直接重编程为黑色素细胞。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了在哺乳动物细胞中生产并浓缩重组慢病毒的方法，可高效递送转录因子或其他遗传元件，适用于细胞重编程、功能研究以及潜在的治疗研究等应用。

方案

1. 转录因子浓缩型慢病毒包装系统的构建

1. 浓缩病毒的生产Figure 1A, B)
   1. Plate 1.5 × 10⁶ 将 HEK (human embryonic kidney)-293T 细胞接种于 60 mm 培养皿中，并使用正常培养基培养这些细胞（参见 Table 1) 于 37 °在含5% CO₂的加湿培养箱中于37°C培养。₂.
      NOTE: 若需分批包装病毒，可使用 100 mm 细胞培养皿（详情参见 Table 2).
   2. 24小时后，确保HEK-293T细胞在转导当天达到80-90%汇合度，并将培养基更换为3.5 mL DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）。’s modified eagle medium) (150 µL of DMEM per 1 cm²将细胞置于37 °在含5% CO₂的加湿培养箱中于37°C培养。₂ for 2 h.
      NOTE: 更换的培养基必须不含血清，以便细胞能够处于“饥饿”状态，从而获得更好的质粒转染效果。 "starved" ....

结果

图1：浓缩病毒的制备及滴度测定。 （A）用未浓缩慢病毒（1x）和浓缩慢病毒（100x）感染HEK-293T细胞后GFP（绿色荧光蛋白）的荧光强度。（B）通过流式细胞术检测未浓缩慢病毒（1x）与浓缩慢病毒（100x）的感染率比较。（C）浓缩慢病毒的滴度估算。比例尺 = 250 µm。缩写：GFP = green fluorescent protein；TU = 转导单位。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.45 μM 滤膜	Millipore	SLHVR33RB
95%/100% 乙醇	LANBAO	210106	室温保存
抗生素（青霉素/链霉素）	Gibco	15140-122	–20 °C 保存
抗 TRP2/DCT 抗体	Abcam	ab74073	宿主/同种型：兔 IgG；种属反应性：小鼠/人；使用稀释比例为 1:200
DMEM（高糖）	HyClone	SH30243.01	4 °C 保存
DMSO	Sigma	D2650	室温保存
FBS	Gibco	10270-106	–20 °C 保存；使用前热灭活
明胶	Sigma	G9391	室温保存
GFP-PURO 质粒（Mitf、Sox10、Pax3、Sox2、Sox9 和 Snai2）	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	–20 °C 保存
苏木精	Abcam	ab220365	室温保存
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	转染试剂，4 °C 保存
PBS (–)	Gibco	C10010500BT	室温保存
佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯（TPA）	Sigma	P8139	储存浓度 1 mM；终浓度 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	阳离子聚合物转染试剂；储存浓度 8 μg/µL；终浓度 4 ng/µL
嘌呤霉素	Gibco	A11138-03	–20 °C 保存
重组人 bFGF	Invitrogen	13256-029	储存浓度 4 μg/mL；终浓度 10 ng/mL
重组人胰岛素	Sigma	I3536	储存浓度 10 mg/mL；终浓度 5 µg/mL