一种替代传统NASA小鼠后肢去负荷模型的新方法

摘要

我们建立了一种小鼠交替性后肢去负荷模型。与传统的Morey-Holton尾部牵引技术相比，我们采用的后肢去负荷尾环法主要优势在于操作简便直接，可最大程度减少对动物的应激反应。

摘要

Morey-Holton后肢去负荷（HU）法是一种被广泛接受的美国国家航空航天局（NASA）地面模型，用于研究啮齿类动物的失用性萎缩^4-6。本研究评估了一种替代标准Morey-Holton HU尾部牵引技术的小鼠实验方法。共54只雌性小鼠（4–8月龄）接受后肢去负荷处理，其中34只持续14天（n=34），20只持续28天（n=20）。另取22只小鼠在去负荷后恢复3天正常笼内活动，以评估其恢复情况（n=22）。另设76只年龄匹配的小鼠作为负重对照组。

在进行HU之前，使用一根2-0无菌外科钢丝穿过尾部形成尾环^th, 6^th，或 7^th 椎间盘间隙并塑造成环状，用于悬挂小鼠。尾环的椎体位置应选择得当，以平衡动物体重，同时不影响排便。

我们通过评估小鼠在悬吊前后的体重、比目鱼肌萎缩程度以及悬吊后肾上腺质量，来判断这种新型悬吊（HU）技术的成功程度。小鼠在悬吊前的体重为 24.3 ± 2.9 g，在经过 14 天悬吊后（22.7 ± 1.9 g）、28 天悬吊后（21.3 ± 2.1 g）或 3 天恢复期后（24.0 ± 1.8 g），体重均未出现显著下降。比目鱼肌质量在悬吊 14 天和 28 天后分别显著降低（-39.1% 和 -46.6%）（p<0.001）。经过 3 天恢复期后，比目鱼肌质量显著回升至对照组的 74%。悬吊组小鼠的肾上腺重量与对照组相比无显著差异。

我们新型尾部悬吊（HU）方法的成功体现在动物体重的维持、肾上腺重量与预期文献值相当，以及悬吊后比目鱼肌出现萎缩，均符合已有报道的文献数值^{2, 7, 8}。该 HU 方法的主要优势包括：1）在悬吊过程中便于对尾部进行检查；2）显著降低尾部缠绕及悬吊过程中常出现的发绀、炎症和/或坏死尾部的发生概率；3）小鼠无法啃咬牵引胶带，避免其脱离悬吊装置；4）悬吊结束后迅速恢复，且立即恢复正常笼内活动。

方案

术前器械/材料

• 剪线钳/镊子
• 2 英寸 × 2 英寸纱布垫
• 加热垫
• 硝酸银棒
• 无菌外科手套
• 异氟烷吸入麻醉剂
• 4% 葡萄糖酸氯己定（抗菌外科洗手液）
• 无菌 2-0 外科不锈钢缝合线
• 25 × 5/8 英寸 A 型针头（已高压灭菌）
• 止血钳（已高压灭菌）
• 外科不锈钢缝合线

手术操作步骤

1. 创建无菌区域。遵循无菌操作规程。
2. 用 2 - 3% 异氟烷麻醉小鼠。
3. 将小鼠置于加热垫上。
4. 用氯己定溶液擦洗尾部。
5. 定位 5、6 或 7^th 椎间间隙（尾部两个骨性突起之间，从体毛末端开始计数，位于尾部基部）。
6. 使用止血钳和25G针头在两个椎骨之间的椎间空间钻出导向孔。
7. 使用钢丝剪将钢丝缝线剪成10 cm长。
8. 移除针头，将钢丝缝线穿过孔洞，使尾部两端各留出5 cm缝线。
9. 尾巴的每一侧应留有 +5 cm 的缝线。
10. 将拇指尖放在尾部。
11. 用空着的手将钢线缝合线缠绕在拇指尖端，并扭转两端形成一个大环。缠绕或环状部分的长度应为+3 mm。
12. 移开拇指。
13. 用止血钳夹住缝合线的一股，并将其弯成一个较小的环，该环的末端应尽可能靠近原始大环上的扭结处。
14. 剪去多余的导线，并将绞合的导线向后弯折。
15. 如果有过多出血，可使用硝酸银棒止血。
16. 关闭异氟烷，将小鼠单独置于饲养笼中，恢复5-7天后再进行后肢悬吊。若多只小鼠共同饲养，尾环可能发生缠绕。

1. 后肢悬吊操作步骤

材料

• 10-24 X 4 规格的机械螺钉，每只动物各一个。
• 10-24 规格的尼龙锁紧螺母，每只动物各一个。
• 10 X 24 规格的翼形螺母，每只动物两个。
• ¼ X 1 规格的垫圈，每只动物两个。
• #6 号、1-11/16 英寸带扣钩的渔用转环，每只动物各一个。
• 金属缝纫机梭芯，每只动物各一个。
• 用于制作 S 形钩的小型回形针，每只动物各一个。
• 钳子。
• 2 英寸 × 2 英寸纱布。
• 2 英寸黑色纸质文件夹夹子。
• 胶带/实验室胶带。
• 略长于笼子全长的 1-3/8 英寸镀层开槽钢条。
• 50 cm × 40 cm × 20 cm 的笼子（大鼠笼）。
• 带弯曲管的饮水瓶。
• 用于支撑饮水瓶的 U 形不锈钢丝。

笼具设置

1. 将1-38英寸带孔镀锌钢条置于笼子顶部，并用胶带暂时固定。
2. 将一个翼形螺母拧到机用螺钉上，套入一个垫圈，然后将机用螺钉穿过钢条上的孔，位置距笼子边缘约±15 cm处。
3. 再加一个垫圈和翼形螺母。拧紧两个翼形螺母，但不要完全拧死，以便后续进行调整。
4. 将机用螺钉穿过线轴中心的孔。
5. 为防止线轴脱落，将尼龙锁紧螺母拧在机用螺钉的末端。线轴应能自由旋转。
6. 将鱼线转环上的弹簧钩穿过线轴的下部。
7. 使用钳子将回形针弯成S形钩。（从回形针上截取2 cm制成钩状。）
8. 将S形钩的一端穿入鱼线转环的孔中，并用钳子夹紧闭合。
9. 将U形金属丝平行于机用螺钉放置在笼子内侧，将两端向后弯曲，以支撑装满水的水瓶。
10. 将水瓶插入U形金属丝中，出水口朝下，但不接触底部。
11. 将2英寸文件夹夹打开，使其无法完全闭合。保持适当张力，刚好可夹住3至4块饲料而不掉落。这样可避免夹子的压力压碎饲料或夹到小鼠鼻部。
12. 将3至4块啮齿类动物饲料放入文件夹夹中。

小鼠后肢去负荷

1. 将S形钩的开口端穿过尾环的小环。
2. 通过拧紧或松开机器螺钉上的下部翼形螺母来调节小鼠的高度，使其后肢不承受体重。达到理想高度后，拧紧上部翼形螺母。
3. 重新放置水瓶和U形金属丝，防止小鼠用后肢攀爬到出水口上。使用Duct胶带将水瓶固定在笼子侧面。
4. 将装有饲料的活页夹置于笼子底部，防止小鼠攀爬其上，并用Duct胶带将其固定。
5. 若在同一笼子的另一侧还需对多只动物实施后肢去负荷，重复相同操作。每笼饲养两只动物，动物之间应保持适当距离，使其几乎可以相互接触。
6. 使用一块2×2的纱布将小鼠尾巴松松地缠绕固定在转环上。用一小段胶带缠绕纱布，以固定纱布和尾巴。此步骤至关重要，可防止尾巴下垂，避免尾尖血液淤积导致坏死。
7. 在笼内添加少量玉米芯垫料。不要添加过多，否则小鼠会堆起垫料并尝试用后肢踩踏垫料以承重。

2. 典型结果：

为了评估尾环悬吊（HU）技术的成功效果，我们测量了各组动物在尾环手术前、悬吊前及悬吊后恢复期间的体重、比目鱼肌质量以及肾上腺质量。

小鼠在整个实验过程中的体重变化如图1所示。尾环手术前的小鼠体重（24.7 ± 3.5 g）与尾环手术后恢复5天、悬吊前的体重（24.3 ± 2.9 g）相比，差异无统计学意义。在悬吊14天后（22.7 ± 1.9 g）、28天后（21.3 ± 2.1 g）以及悬吊后恢复3天时（24.0 ± 1.8 g），体重也未出现显著下降。尽管持续14天和28天的悬吊导致了轻微的体重减少（分别为-6.8%和12%），但差异无统计学意义，且小鼠在悬吊后经过3天恢复，体重已完全恢复至悬吊前水平。自由活动对照组小鼠与悬吊组小鼠的食物摄入量如图3所示。在28天实验期间，悬吊组小鼠的平均每日食物摄入量与对照组相比无显著差异。

我们观察到，尾部悬吊（HU）14天和28天后，比目鱼肌出现显著萎缩（分别减少39.1%和46.6%），表明悬吊操作有效（图2）。此外，该程度的萎缩与文献报道的2至4周悬吊所预期的数值一致^{2, 7, 8}。悬吊后经过3天恢复，比目鱼肌质量显著回升至对照组的74%。恢复组的比目鱼肌质量显著高于两个悬吊组，但仍显著低于自由活动的对照组动物。

以肾上腺重量作为动物应激的指标；切除左右两侧肾上腺并称重。所有组别中，对照组小鼠与 HU 小鼠的平均重量相当（图 4）。

此前在大鼠实验中，我们采用Morey-Holton技术发现，开始进行悬吊（HU）的动物数量与顺利完成HU而未从悬吊装置中脱出（因动物咬断尾部牵引胶带所致）的动物数量相比，成功率为12只中有10只¹。本研究中的所有小鼠（n=54）均未在HU期结束前从悬吊状态中提前脱落。然而，有1只小鼠出现了严重的尾部炎症。当炎症表现明显时，我们移除了尾环以使炎症区域得以愈合，随后重新安装另一个尾环以完成剩余的HU周期。

过去使用Morey-Holton悬吊法时，我们通常每组会淘汰1-2只小鼠，因为它们会从悬吊装置中脱出。而采用牵引环法后，在14天或28天的悬吊期间，未发生小鼠意外脱离悬吊装置的情况（共54只小鼠）。

图1. 体重变化（均值 ± 标准差）。缩写：CON：负重对照小鼠（n=76）；Pre-HU：所有小鼠在尾部悬吊前（n=54）；HU14：尾部悬吊14天的小鼠（n=34）；HU28：尾部悬吊28天的小鼠（n=20）；REC：尾部悬吊后允许在笼中恢复3天的小鼠（n=22）。各组间体重未观察到显著差异。

图2. 比目鱼肌萎缩（均值 ± 标准差）。缩写：CON：负重对照小鼠（n=76）；HU14：后肢悬吊14天的小鼠（n=34）；HU28：后肢悬吊28天的小鼠（n=20）；REC：后肢悬吊后在笼中恢复3天的小鼠（n=22）。*与负重对照组（CON）相比差异显著（p<0.001）。δ与两个HU组相比差异显著（p<0.01）。

图3. 食物消耗量（均值 ± 标准差）。在负重状态和后肢悬吊期间的平均每日食物摄入量（g/天）。缩写：负重对照小鼠（n=76）；HU：后肢悬吊小鼠，14 - 28天。CON组与HU组之间未观察到显著差异。

图4. 肾上腺质量（均值 ± 标准差）。缩写：CON：负重对照小鼠（n=76）；HU14：后肢悬吊14天的小鼠（n=34）；HU28：后肢悬吊28天的小鼠（n=20）；REC：后肢悬吊后允许在笼中恢复3天的小鼠（n=22）。各组之间未观察到显著差异。

讨论

我们评估了一种后肢去负荷小鼠的替代方法，发现该方法效果非常理想。本文所述的尾环法可用于长期后肢悬吊以及悬吊后恢复过程的研究。在上述各种条件下，小鼠均未出现适应失败的迹象，表现为食物摄入量、体重和肾上腺重量均保持稳定。这种尾环式后肢去负荷技术操作简便，几乎无需外科手术训练即可快速掌握并应用。

与传统的 Morey-Holton^{5, 6}方法相比，尾环法具有多项优势。首先，尾部皮肤及环状装置植入部位始终可见，因此一旦出现问题可立即发现，而不仅限于悬吊期结束时才能察觉。其次，在头低位悬吊（HU）期间，动物无法随时脱离悬吊装置，从而避免了需判断是否应将某只小鼠保留在数据集中的问题。此外，小鼠不会干扰环状装置，且在结束 HU 恢复活动后也不会抓挠或损伤尾部，使 HU 后的恢复阶段得以顺利进行。最后，采用尾环法进行后肢去负荷的小鼠，其体重维持优于使用 Morey-Holton 尾部牵引技术去负荷的小鼠。在我们的实验中，经过 14 天 HU 后，小鼠仅出现轻微（-6.8%）且无统计学意义的体重下降；而 Ingalls 等通过 Morey-Holton 方法进行 14 天 HU 后，观察到小鼠体重显著下降了 12%³。尽管 Ingalls 未报告肾上腺重量数据，但我们的结果显示，尾环法对小鼠造成的应激更小（HU 小鼠的肾上腺重量与对照组无差异），并在整个后肢去负荷期间更好地维持了体重。

综上所述，我们建立并测试了一种采用尾环法进行后肢悬吊的小鼠模型，分别实施了14天和28天的后肢悬吊，并在悬吊后恢复笼内饲养3天。根据肾上腺重量、体重及摄食量的分析结果，小鼠对尾环装置表现出良好的适应性。尾环法后肢悬吊技术是一种有效且简便的方法，可作为传统Morey-Holton后肢悬吊技术的替代方案。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
剪线钳/钳子	Ace Hardware	84-056
纱布	Fisher Scientific	22-037-901
加热垫	Sunbeam	Z-1228-001
硝酸银涂抹器	ARZOL	0001-2
异氟烷，USP	Novaplus	NDC 0409-3292-49
4% 葡萄糖酸氯己定	Purdue Products L.P.	NDC 67618-200-01
无菌2-0号外科不锈钢缝合线	Ethicon Inc.	SS-28
25号×5/8英寸针头	Terumo Medical Corp.	NN 2516R
止血钳/持针器	Fine Science Tools	12500-12
10-24×4号机制螺钉	Hillman The Fastener Center	90272
尼龙锁紧螺母，10×24号	Hillman The Fastener Center	180141
翼形螺母，10×24号	Hillman The Fastener Center	180243
挡圈垫片，¼×1英寸	Hillman The Fastener Center	290012
带扣钩的鱼钩转环，#6号，1-11/16”	Bass Pro Shop	38-481-554-01
金属缝纫机梭芯	Singer Instruments	45785
回形针	Office Depot	221720
2”黑色纸质文件夹夹具	Office Depot	308957
Scotch多功能 duct 胶带	Office Depot	790710
1-3/8”镀层开槽钢条	Home Depot	548932	略长于笼子的全长
50 cm × 40 cm × 20 cm 笼子（大鼠笼）	Alternative Design Manufacturing	RC88D-PC
饮水瓶	Alternative Design Manufacturing	WB16FS
不锈钢丝	Small Parts, Inc.	SWX-4029	用于支撑饮水瓶的U形金属丝