报告基因携带型埃博拉病毒转录与复制能力病毒样颗粒的制备

摘要

本视频展示了如何将模拟埃博拉病毒基因组的四顺反子微型基因组质粒与辅助质粒共同转染入人源细胞。在细胞内，病毒蛋白和荧光素酶得以表达，进而组装并出芽形成无致病性但具有复制能力的病毒样颗粒。

1. 转录和复制能力型病毒样颗粒（trVLPs）的初始生产：生产细胞的转染

细胞传代后24小时（实验时间安排概览见图1），使用带滤芯的吸头将质粒DNA（用量见表1）加入无菌2 mL冻存管中。每孔加入100 µL OptiMEM至DNA中。短暂涡旋混合液，然后使用微量离心机轻轻离心以沉降管壁液体。若多个孔需转染相同的质粒，可配制多个孔用量的主混合液。
使用前对含Transit LT1的冻存管进行短暂涡旋。每孔向稀释后的DNA中加入7.5 µL Transit LT1。轻轻涡旋混合，注意避免液体聚集在冻存管盖内，室温孵育15分钟。
通过上下吹打轻轻混匀转染复合物。将100 µL转染复合物逐滴加入每孔中。前后及左右轻轻摇动培养板以均匀分布转染复合物。切勿旋转摇动培养板，以免转染复合物分布不均。
将细胞放回培养箱中继续培养。
24小时后，移除细胞上清液。向每孔细胞中加入4 mL含5% FBS（胎牛血清）、2 mM L-谷氨酰胺、1×青霉素/链霉素（pen/strep）的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）（DMEM5）。若各孔样品相同，此步骤可同时处理最多3个孔，且不会导致孔内干燥（否则，由于本系统中trVLPs（转录与复制能力病毒样颗粒）具有自我扩增特性，可能发生交叉污染，此时应逐孔单独操作）。
将细胞放回培养箱中继续培养。

表1. 转染用DNA用量。 每种质粒在6孔板每孔中用于转染生产细胞和靶细胞的用量，以ng为单位列出。

图1. 连续三轮传代的四顺反子trVLP检测时间安排。 图中显示了连续三轮传代（以箭头表示）中细胞接种（s）、细胞转染（t）、细胞感染（i）、换液（c）以及细胞和trVLPs收获（h）的时间安排。